人力蕈状味觉​​乳头细胞的分离和培养

Summary

我们旨在建立一个孤立和维护人类菌状的味道乳头细胞的长期文化重现协议。活检取自人体的菌状乳头细胞成功地保持了八个多通道（12个月）没有丧失活力的文化。

Abstract

味觉细胞是高度专业化的，具有独特的组织学，分子生物学和生理特性，允许一个简单的刺激和食品中含有复杂的化学分子的广泛检测。在人类，个体的菌状乳头，包含从零到多达20个味蕾。有没有人的味觉细胞培养建立的协议，尽管保持文化品位乳头细胞的多种细胞周期的能力将是相当实用，这些独特的感官细胞的特征分子，再生和功能特性。味觉细胞的早先的研究已经完成，使用新鲜细胞原代培养，外植体培养，从啮齿类动物或半完整的味蕾，在组织切片^1,2,3,4。虽然这些准备工作的每个人都有优势，将有长远的文化发展提供了重要的好处，特别是对味觉细胞增殖和复合驱研究rentiation。几个团体，包括我们在内，一直在味觉细胞培养模型的建立和发展有兴趣。大多数尝试以文化品位细胞报道有限的活力，细胞通常不超过^3-5ð5,6,7,8持久。我们最近报道对啮齿动物的味觉细胞⁹扩展文化的一个成功的方法。我们在这里报告的第一次孤立的人类蕈状味觉乳头细胞在体外培养体系的建立。活检取自人体的菌状乳头细胞成功地保持了八个多通道（12个月）没有丧失活力的文化。细胞表现出成熟的味觉细胞特征的许多分子和生理功能。 Gustducin和β2，磷脂酶C（PLC - β2）的mRNA在许多细胞，通过逆转录 - 聚合酶链反应检测和测序证实。免疫细胞化学分析表明，在场的阵风ducin和PLC-β2培养味觉细胞中的表达。体外培养的人蕈状细胞也表现出适当的浓度表明，味觉受体和信号通路至少是目前的几种口味刺激细胞内钙离子的增加。这些结果充分表明，成年人类的味觉细胞可以产生和保持为至少8个通道。许多人保留着细胞的急性分离的从成年味道上皮细胞，以支持其作为一种模式味觉系统的使用和生理生化特性。这个系统将使参与增殖，分化和功能在哺乳动物味觉受体细胞， 在体外制备过程的进一步研究。

蕈状人的味觉乳头建立人力蕈状细胞培养的捐赠研究适当的知情同意后，根据研究进行了审查协议由IRB委员会批准。舒尔曼联营机构审查委员会公司，俄亥俄州辛辛那提市批准的协议（＃0934）。书面协议下面是根据报告公布的参数由Ozdener 等 。 2011年^10。

Protocol

1。获得人力蕈状味觉​​乳头

1. 取出四到八个舌头的前部分采用弧形弹簧microscissors背表面的菌状味觉乳头。
2. 立即进入隔离解决方案的地方（ _碳酸氢钠 26毫米，2.5毫米的NaH ₂ PO _4计 ，葡萄糖20毫米，65毫米氯化钠，氯化钾20毫米，1毫米EDTA在无核酸酶水溶解和过滤消毒）。

2。人菌状的味道乳头消解

人蕈状味觉细胞乳头可以是分离的，使用两种不同的酶消化协议略有不同。

1. 在隔离解决方案（1毫克/毫升，Sigma Aldrich公司）与蛋白酶和弹性蛋白酶（1毫克/毫升Sigma Aldrich公司），在室温30-45分钟（协议）的菌状乳头孵育。
2. 菌状乳头孵育与胶原酶I型（550 U / ml的，从沃辛顿）+弹性蛋白酶（10 U / ml的，从麦汁hington）+胰蛋白酶抑制剂（0.9毫克/毫升，从沃辛顿）2毫升钙免费林格液35°C间为30分钟和95％的O _{2/5％CO 2的}温柔氧合循环水浴（替代方法消化，协议2）
3. 孵育后，用铃声的乳头和磨碎用火抛光玻璃巴​​斯德吸管10倍的乳头。
4. 离心3分钟，在室温下在2500转和删除隔离的解决方案和味觉细胞的培养基中添加1毫升。
5. 转移到玻璃盘的消化菌状乳头。
6. 菌状乳头，轻轻地用解剖手术剃刀。
7. 添加到克隆到鼠尾胶原蛋白1型涂层盖玻片缸250解剖乳头液。
8. 每孔加入1毫升的味觉细胞培养基。

3。蕈状味道人类乳头细胞的培养

1. 在36°C孵育板在加湿孵化器含有5％CO _2。
2. 2天前的第一个变化完全培养基放置在孵化器不受干扰。味觉细胞，最终将绑定到涂层的盖玻片，虽然它可能不是清晰可见，在1至3天。
3. 从克隆板和中缸完全，并添加到每口井的味觉细胞培养液1毫升。
4. 中期每6-7天更换1/3。不改变更频繁和/或完全培养基。
5. 隔日检查，显微镜下细胞的生长。大多数新的细胞生长细胞簇之下。通常分离培养2-3周后离开新产生的细胞的细胞团。
6. 一旦扩大味觉细胞覆盖40-50％的克隆缸，trypsinize细胞使用2-3分钟0.25％W / V胰蛋白酶/ EDTA在36°C。
7. 转入15毫升管从水井细胞，味觉细胞的培养基中添加3卷在3000转离心5分钟，在室温下的温升。
8. 删除1毫升口味细胞培养基上清，重悬细胞。

4。传播人类的蕈状味道乳头细胞

1. 转入的T25板细胞和味觉细胞培养液（通道0）添加4毫升。保持在36°C在加湿孵化器的含5％CO _2的细胞。
2. 中期每6-7天更换1/3，直到培养味觉细胞已达到100％汇合。此时收获，使味觉细胞，用无菌PBS洗细胞一次，然后trypsinize细胞使用2-3分钟0.25％W / V胰蛋白酶/ EDTA在36°C。
3. 如上所述，离心后，悬浮在新鲜的T-75瓶（通道1）完整的味觉细胞培养液和转移细胞。
4. 中期每6-7天更换1/3。不改变更频繁和/或完全培养基。
5. 重复步骤4.3和4.4时，细胞已达到接近100％汇合。细胞分裂中的T75瓶不超过1:4稀释细胞保持足够的增长，随着时间的推移。

5。培养人的蕈状味觉乳头细胞冻融

1. 冻结初级味觉细胞的股票后，胰蛋白酶（步骤4.2），加3毫升完整的味觉细胞介质和细胞转移无菌15毫升锥形离心管。在室温下5分钟在2500转离心。
2. 冷冻介质中含95％胎牛血清（FBS）和5％DMSO适当的音量，小心取出上清液，轻轻重悬细胞。
3. 转移细胞标记，无菌冷冻管，盖紧瓶盖，冷冻集装箱含有异丙醇的地方。到1 -80℃至少一天前无限期地转移到液氮冷冻的地方。
4. 解冻一小瓶冷冻首要人权蕈状味觉乳头细胞，地点在37℃水浴，直到刚刚解冻（约1分钟），而在层流细胞培养工作罩。
5. 细胞和冷冻介质转移到无菌的15毫升锥形离心管和味觉细胞的培养基中添加5毫升。
6. 在室温下5分钟2500转离心细胞。小心弃上清，完整的味觉细胞培养液中，并转移到无菌的T-25的组织培养瓶轻轻重悬细胞。
7. 根据步骤3到4，继续培养细胞。

6。代表结果

成长的文化品位活检的尝试是成功的90％以上的时间。活检和分解后几天，细胞开始生长和解剖蕈状组织块分离程序后仍然向外迁移。虽然单个细胞可见电镀（ 图1A）24-48小时后，细胞生长到2-3周连接的细胞簇下，偶尔会产生子细胞（ 图1B）。从活检ING 4-8人的菌状乳头，初步分离的首要人权蕈状味觉乳头细胞达到约2000 - 8000细胞在4周文化。扩张的T25细胞培养瓶，额外的3-4周（通道0），将导致在文化适应人蕈状味觉乳头细胞（ 图1C）。首要人权蕈状味觉乳头细胞可以进一步扩大在文化，通过-1在3-4周（ 图1D）至少有一百万个细胞产生向上。主要的味觉细胞会继续增长超过8通道。

文化品味培养人的蕈状乳头细胞的形态是培养化学感受细胞类似前面描述^11,12 ......培养人蕈状味觉乳头细胞保持其原始细胞体小巧美观，带或不带一个或多个进程长达15-30天。当他们到达汇合培养CELLS有极化-拉长的外观。成熟的味觉细胞组成几个不同的组织学亚型和展览味觉细胞的特定功能。在这里，我们表明，在这些文化中的细胞显示许多分子和生理功能，成熟的味觉细胞的特征。 Gustducin和磷脂酶C - β2（PLC-β2）mRNA的逆转录-聚合酶链反应和测序（ 图2）确认产品检测。 Gustducin和PLC-β2表达检测免疫细胞化学显示II型样细胞（ 图3，B和D）的存在。 Gustducin和的PLC-β2反映细胞信号通路和细胞类型的不准确地反映体内的患病率和相对表达模式。不同类型的细胞内的味蕾相对分布的因素是未知的，在培养条件，不得复制。因此，B之间培养的细胞，其在体内的同行提供了一个机会，在分子水平上研究这些特点的监管，可以操纵和监控的条件下，超视距异同。

一个模型系统的一个重要的标准是存在相关的功能特性。培养的细胞还表现在几个味觉刺激（ 图4）适当浓度细胞内钙的强劲增长。在这些研究中，甜和苦的刺激，引起细胞内钙的增加可能对应到去极化。像这些味觉细胞，培养细胞的性质贷款支持的说法，我们在这里描述的模型系统将是一个宝贵的资产为进一步研究转导通路和人的味觉细胞的再生能力。

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图1。附件和培养人的菌状的味道乳头细胞形态。成像后2天（A）的首要人权蕈状味觉乳头细胞生长在胶原涂层板-1型文化。人类蕈状的味道乳头细胞生长最多4个星期在连接的细胞团，这似乎给子细胞产生。细胞通常增长汇合四个星期内（二），（C和D）收获后，补种分别代表天2周和4周。细胞培养至少8个月持续增长。比例尺= 50纳米。 图1部分还介绍了在Ozdener 等。 ^10。

图2 RT-PCR结果显示在特定的味觉细胞的生物标志物的mRNA（Gustducin和PLC-β2）的存在。从培养人的蕈状细胞的总RNA反转录ribed用于RT-PCR（Invitrogen公司）使用上标第一链合成系统和PLC-β2Gustducin和检测设计的特异引物扩增的PCR用。引物（ 表1）被选为跨越一个或多个内含子。每个基因检测在体外培养的人蕈状的味道，从乳头细胞通过4或5的预期大小的扩增产物，经测序证实。没有反向酶表示基因组DNA污染，没有特定的基因控制实验检测。 PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离和凝胶的扩增产物用剃刀切除。提取DNA，使用凝胶QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen）。在宾夕法尼亚大学测序设施PCR产物进行测序。的C-PCR和C-RT PCR和逆转录的对照实验，分别。 图2部分还介绍了在Ozdener 等。等。

图3。培养的人类味道蕈状乳头细胞通过4个或5个免疫组织化学染色表明味觉细胞的生物标志物的存在。培养人的蕈状味觉乳头细胞（5天），用4％多聚甲醛固定，培养小学抗体（见表2）在4°C过夜图像被收购的Leica TCS SP2激光共聚焦扫描显微镜。大约60％的培养菌状的味道乳头细胞标记gustducin（B）和（四）与PLC-β2的20-30％。相应的细胞传输图像显示（A和C）。对于控件，与抗体的特异性免疫球蛋白免疫证明的非特异性免疫反应（数据未显示）的情况下。比例尺= 50纳米。部分图3中还介绍了在Ozdener 等。 ^10。

图4。培养人的蕈状的味道，从第4代或5乳头细胞不同刺激作出反应。培养人的蕈状味觉乳头细胞（4-5日龄）被载入1MM的Fura-2 AM（分子探针）和10毫克/毫升聚醚F127的（分子探针）。使用标准手册成像技术在体外培养的人蕈状味觉乳头细胞的细胞内钙离子水平（内[Ca ^{2 +]} i）的变化进行测量。细胞可视化使用倒置荧光显微镜在340 nm和380 nm的激发波长和发射波长在510 nm带通滤波器中心设置。刺激的沐浴液，然后溶解在pH值和渗透压的调整，如果需要的话。培养人的蕈状味觉乳头细胞，甜和苦的刺激。 Ğ微晶说明代表反应的[Ca +2]我接触（一）Denatonium（2毫米），（二）蔗糖（1毫米）在单个细胞水平。每个跟踪代表单个体细胞。

基因	序列	PCR反应条件		预计规模 （BP）	参考
β-肌动蛋白	GGACTTCGAGCAAGAGATGG AGCACTGTGTTGGCGTACAG	7分钟 45秒 45秒 45秒 7分钟	95 94 53 72 72	234	NM_001101.3
gustducin	TCTGGGTATGTGCCAAATGA GGCCCAGTGTATTCTGGAAA	7分钟 45秒 45秒 45秒 7分钟	95 94 53 72 72	386	NM_001102386
PLC-β2	GTCACCTGAAGGCATGGTCT TTAAAGGCGCTTTCTGCAAT	3分钟 30秒 30秒 60秒 7分钟	95 94 53 72 72	333	NM_004573

表1。品尝特定分子检测引物和使用条件。

初级抗体	源	主持人	稀释	二级抗体	源	主持人 稀释
gustducin	圣克鲁斯	兔	1:500	抗兔IgG 633网站	分子探针	山羊	1:500
PLCβ-2	圣克鲁斯	兔	1:500	抗兔IgG 633网站	分子探针	山羊	1:500

表2。抗体用于检测特定分子的表达。

Discussion

我们一直保持着味道从人类的蕈状乳头细胞获得超过8通道，横跨12个月的期限。这些文化产生新的细胞，其中许多在体外成熟的阶段，他们表示，除了味觉受体细胞的关键分子和生理属性的几个指标，成熟的味蕾细胞类型。存在gustducin和PLC-β2在培养的细胞亚群的免疫反应是与这一结论相一致。最重要的是，某些细胞对甜和苦味刺激的应用与细胞内钙离子的短暂增加，这是一个功能分离的味觉细胞，在细胞的味蕾片³和培养人类和老鼠的味觉细胞^19,10。这表明不仅是文化的一些细胞表达的分子受体甜和苦，但他们有足够的G蛋白偶联转导级联产生calciUM回应。

长期的初级细胞培养往往不能保持原有的组织和细胞结构和细胞因子可能发挥作用，在细胞的生理功能。由人类菌状的味道乳头细胞培养的长期成功的建立，已经取得了很大进展，但必须提到的一些限制。其中最重要的是，每批原代培养细胞可以在初始种群的细胞用于启动的文化的差异而有所不同。初级细胞培养，往往错过了原来的组织机构和结构和生长因子，细胞的生理功能中发挥作用。细胞往往不总是完全与其他细胞接触，因为文化从来没有发展到100％汇合。在一般情况下，原代细胞也受到分化，染色体不稳定，李连续细胞中的细胞复制过程中染色体的损失或收益的特点未列明在其他编号，可能是另一个问题^13,14,15。与舌养殖nontaste细胞培养人类的蕈状细胞的比较，需要探索。这些问题将需要许多实验方法和模型系统的使用，我们的理解是之前完成。

总之，本协议此处所述不失有关的细胞生理及分子特征可以维持至少8通道（12个月）的味道人类蕈状乳头细胞在体外 。这个长期小学文化的进一步发展将提供的增殖和分化，刺激特异性，相声和适应人的味觉受体细胞，以及组织再生研究的模型系统。此外，在条件的影响，损害的味道，如感染细胞的功能，药物，辐射，有毒或化学暴露可以在分子和生理水平研究。