Summary
هنا علينا أن نبرهن بروتوكول لدينا لعزل الخلايا القاعدية وتحت المخاطية قناة الغدة من القصبات الماوس. علينا أن نبرهن أيضا طريقة حقن الخلايا الجذعية في لوحة الماوس الدهون الظهرية لإنشاء
Abstract
الشعب الهوائية الكبيرة على اتصال مباشر مع البيئة وبالتالي عرضة للإصابة من السموم والعوامل المعدية أننا في التنفس 1. الشعب الهوائية الكبيرة تتطلب بالتالي إصلاح آلية فعالة لحماية أجسامنا. هذه العملية يحدث إصلاح من الخلايا الجذعية في الشعب الهوائية وعزل هذه الخلايا الجذعية من الشعب الهوائية من المهم لفهم آليات الإصلاح والتجديد. من المهم أيضا لفهم إصلاح الشاذة التي يمكن أن تؤدي إلى أمراض الشعب الهوائية 2. والهدف من هذا الأسلوب هو لعزل الخلايا الجذعية من رواية سكان القصبة الهوائية الماوس القنوات الغدة تحت المخاطية ووضع هذه الخلايا في المختبر في وأنظمة نموذج الجسم الحي للتعرف على آليات إصلاح وتجديد الغدد تحت المخاطية 3. يظهر هذا الإنتاج الأساليب التي يمكن استخدامها لعزل وفحص الخلايا الجذعية لاصق والقاعدية من الشعب الهوائية كبيرة 3، مما سيسمح لنالدراسة أمراض الشعب الهوائية، مثل التليف الكيسي، الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن. حاليا، لا توجد طرق لعزل خلايا الغدة تحت المخاطية القناة وليس هناك أي نماذج في الجسم الحي لدراسة تجديد الغدد تحت المخاطية.
Protocol
الخطوط العريضة للخطوات
1. تشريح القصبة الهوائية
2. تنظيف القصبة الهوائية وقطع عليه
3. انزيم الهضم ومعالجة في التعليق خلية واحدة
4. لتلطيخ FACS والفرز
5. معالجة الخلايا في الجسم الحي لفرز ونماذج في المختبر
1. تشريح القصبة الهوائية
- الموت ببطء الماوس مع حقنة داخل الصفاق من نسخة 0.1 من mg/0.2 بنتوباربيتال.
- خفض فتح جدار البطن، ونقل إلى الجانب الأمعاء لفضح الشريان الأورطي البطني ومن ثم تشريح ذلك.
- فتح الصدر عن طريق قطع من خلال الحجاب الحاجز وجدار الصدر الأمامي على جانبي لفضح القلب والرئتين. مواصلة قطع يصل الى الرقبة إزالة الغدد اللعابية والدهون لفضح القصبة الهوائية.
- إزالة الغدة الصعترية وقطع الرئة من اتصالات إلى ما دون وراء. Separيأكلون من القصبة الهوائية والمريء عن طريق إدراج ملقط بينهما ثم قطع القصبة الهوائية في الجزء العلوي من معظم أعلاه اتصاله مع الحنجرة. ثم عقد القصبة الهوائية مع ملقط تشريح وذلك من حرصه ومواصلة الهبوط لإزالته مع القلب والرئة EN-كتلة. قطع القلب والرئتين بالقرب من نقير لتشمل معظم الشعب الهوائية الرئيسية اليمنى واليسرى.
- وضع القصبة الهوائية في طبق بتري صغيرة تحتوي على جمع المتوسطة على الجليد.
2. تنظيف القصبة الهوائية وقطع عليه
- تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط نقطة دقيقة جدا (رقم 5) ومقص Vannas توبنجن (FST 15003-08 finescience.com) لتنظيف القصبة الهوائية من أنسجة سائر المرتبطة به. وهذا يشمل: الغدد الليمفاوية، العصب الحنجري المتكررة، والدهون والغدة الدرقية والأوعية الرئوية المتبقية. الجزء العلوي من القصبة الهوائية يحتاج إلى عناية خاصة، لإزالة غضاريف الحنجرة كبيرة دون المساس أكبر مجموعة من SMGوقدمت بين أن الغضروف الحلقي، وأول حلقة الغضروفية القصبة الهوائية (C1) 4.
- قطع القصبة الهوائية في الجزء العلوي والجزء السفلي بين C4 C5 وفوق فتح وقطع كل أجزاء من خلال تجويف القصبة الهوائية.
3. انزيم الهضم ومعالجة في تعليق خلية واحدة (SCS)
- احتضان الجزء السفلي من القصبة الهوائية في 1 مل من dispase U 16 في أنبوب إيبندورف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة، كما هو موضح سابقا 5. ثم يضاف 0.5 ملغ / مل الدناز I في DMEM ل20 دقيقة إضافية في RT.
- إزالة القصبات هضمها في جمع الطازجة المتوسطة في طبق بتري معقمة، وتجريد ظهارة السطح تحت المجهر تشريح. استخدام ماصة لنقل متوسطة تحتوي على ظهارة جردت إلى أنبوب 50 مل المخروطية.
- تدور أسفل ظهارة جردت في 1،000 XG في C. ° 4 إزالة طاف، وإضافة 0.1٪ التربسين / EDTA واحتضان بينما تهز الأنبوب ه في 37 ° C تهز الحاضنة (200 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وذلك باستخدام معلومات سرية ميكرولتر 1000، ماصة صعودا وهبوطا لتفريق كتل وتشكيل التعليق خلية واحدة.
- وضع القصبة الهوائية العليا في أنبوب مخروطي يحتوي على 1 مل من pronase 0.15٪. ثم في احتضان C ° 4 لمدة 4 ساعة.
- دوامة بلطف ثم ضع أنبوب القصبة الهوائية في جمع الطازجة والمتوسطة تأكيد تشريح تحت المجهر أن هناك حياد تام للظهارة السطحية (SE).
- اللحم المفروم القصبة الهوائية مع غرامة مقص لفتح حجرات SMG ومن ثم احتضان لمدة ساعة في أكثر pronase في RT مع اهتزاز بطيء.
- تدور القصبة الهوائية أسفل الأنسجة، وإزالة pronase، إضافة 0.1٪ التربسين / EDTA واحتضان في C ° 37 لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز على النحو الوارد أعلاه.
- مرور الخلايا هضمها، وكتل أي قطع ما تبقى من الغدد عن طريق الإبر 20G، 23G 26G وباستخدام حقنة 10 مل. كرر مرات عدة مع كل الركض حجم الإبرة قبلتنحيه. الآن، ينبغي أن تكون معظم الخلايا في SCS.
- تصفية التعليق من خلال مصفاة ميكرومتر 40 ثم يغسل مصفاة وتدور أسفل الخلايا. ثم إعادة الخلايا في حجم مناسب من المتوسطة، عد الخلايا والشروع فورا في FACS تلطيخ والفرز. لا تترك الخلايا في C ° 4 أو على الجليد لعدة ساعات لأننا وجدنا أن هذا يؤثر على سلامة ويقلل كثيرا من كفاءة المجال تشكيل.
4. لتلطيخ FACS والفرز
- أخذ خلايا كافية للإعداد غير ملوثين واحد أنابيب التعويض الملون وصمة عار ثم بقية الخلايا مع أجسام مضادة الأولية، Trop2 الماعز والفئران ITGA6، لمدة 15 دقيقة في RT. ثم تغسل مع PBS أو جمع المتوسطة، مزيل طاف بعناية فائقة وكسر بيليه الخلية.
- وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، احتضان في الظلام في RT لمدة 10 دقيقة، وغسل وإزالة طاف وكسر ثم بيليه.
- على FACSARIA، بعد تعديل الجهد الخاص والتعويض، من بوابة الانقاض، وخلايا صغيرة جدا، والحلل الخلية الخلايا الميتة. ثم، ينبغي أن معظم الخلايا من تكون SE TROP2 إيجابية بينما 20-50٪ من الخلايا SMG سيكون TROP2 + 6.
- تعيين البوابة الخاص بك لفرز Trop2 + + الخلايا من ITGA6 SE (الخلايا القاعدية) وTrop2 + الخلايا (+ /-ITGA6 خلايا إيجابية) من SMG (خلايا القناة).
5. تجهيز خلايا الترتيب ل: في المختبر الثقافة والموديل في الجسم الحي
5.1 في مجال المختبر تشكيل الثقافة 5-9
- "خفض عامل نمو Matrigel" مزيج من 100 ميكرولتر مع 100 ميكرولتر من المتوسطة 10،11 كاملة (انظر الجدول 1) التي تحتوي على ما يصل الى 50،000 الخلايا مصنفة ثم وضع هذا الخليط في مجلس الشيوخ من بئر العابر 24 أيضا. وضع ثم 400 ميكرولتر من المتوسطة كاملة في مجلس النواب واحتضان عند 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة في مجلس النواب كل يوم إضافي وإضافة 100 ميكرولتر من Matrigelكل أسبوع أو قبل ذلك إذا أصبحت رقيقة.
5.2 في نموذج الجسم الحي
- إعادة فرز الخلية بيليه في المتوسط كاملة مختلطة 1:1 مع matrigel بتركيز 5،000-10،000 الخلايا في 50 ميكرولتر.
- تخدير المتلقي C57/BL6 الفئران. إدارة كاربروفين (5 ملغ / كلغ) subcutaenously بمثابة مسكن. تعقيم ويحلق ظهورهم ثم إجراء شق الجلد المركزية طولية في الجزء الأعلى من الظهر. ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي شق لتحديد موقع الدهون حقن سادة فضلا عن فقاعة تشكل بعد الحقن. استخدام الجانب حادة من مقص لتوسيع الحقائب بين الجلد والخلفي من جدار الصدر من الجانبين لتحقيق أقصى قدر من الوصول والتصور.
- تحديد الحدود وسطي للكتف عن طريق دفع forelimb الماوس لأعلى والخلف لرؤية الحركة لوح الكتف. تأخذ 50 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى 300 ميكرولتر BD حقنة الانسولين وحقنه في لوحة الدهون الإنسي عادل للكتف والجانبية لالفقرات. يجب أن تكون قادرا على رؤية فقاعة خلاف ذلك كنت عميقة جدا. تكرار نفسه على الجانب الآخر مقطع أو غرزة ثم شق الجلد. تحقق الفئران وإعطاء كاربروفين (5 ملغ / كغ، SC) مرة واحدة يوميا لمدة 48 ساعة.
- بعد 3 أسابيع، الموت ببطء مع الفئران pentobarbatol (0.1 mg/0.2 سم مكعب، IP)، فتح الجلد على النحو الوارد أعلاه وتشريح كامل لوحة الدهون من الجانبين مع هامش أمان لتجنب فقدان أي بنية الأنسجة التي ربما شكلت وتمديد حولها. إصلاح في PFA والبارافين في تضمين 12. ينبغي استخدام الحذر الشديد أثناء تقليم وقطع كتلة عدم تجاوز أو تجاهل هيكل. أفضل الممارسات لخفض 40 ميكرون ثم مرة واحدة قطع شريحة ميكرون 4، ضعه على شريحة زجاجية وفحصها تحت المجهر للتأكد إذا كان هناك أي "هياكل الظهارية" في هذا الجزء من كتلة أم لا. إذا كان هناك أي شيء ينظر إليه، ثم خفض مرة أخرى وكرر هذه الخطوة.
6. ممثل النتائج
يتوسوف pping من القصبات الماوس يؤدي إلى القصبة الهوائية المعري التي مرئيا بواسطة المجهر الضوئي كما هو موضح في الشكل 1A. 1B الشكل يبين وجهة النظر brightfield من القصبة الهوائية بعد تجريد الظهارية مع الغدد تحت المخاطية الإفراج عنه من الأنسجة وباقات تشبه العنب.
Pronase يزيل حاتمة ITGA6 وهذا هو السبب في أن الخلايا لا يمكن فصلها TROP2 القناة في ITGA6 + و- السكان. ومع ذلك، dispase، الذي يحافظ على حاتمة ITGA6، يساعد على هضم جميع ظهارة السطحية وخلايا القناة حتى مع أوقات حضانة قصيرة جدا، وبالتالي لا يمكن استخدامها لفصل الخلايا القاعدية من القناة 3. يجب التدفق الخلوي للتعليق خلية واحدة إلى الأمام تظهر المخططات مبعثر مبعثر والجانبية التي تتمثل في الشكل 2A. فصل الخلايا جيدة القناة عن بقية ما إذا كان ينبغي أن ينظر إلى الخلايا القصبة الهوائية مع الأجسام المضادة Trop2 في التدفق الخلوي لخلية المنشط الفلورسنت sortiنانوغرام (FACS) كما رأينا في الشكل 2B. يجب أن تكون مرئية المجالات في matrigel بعد حوالي 1 أسبوع في الثقافة وكثيفة في المظهر كما هو موضح في الشكل 3. كفاءة هذه العملية هو أمر 1-2٪ والخلايا واحدة ستظل موجودة في matrigel وتمثل الخلايا من المحتمل القنوات الغدة تحت المخاطية التي لا تمتلك القدرة على التجديد الذاتي. حقن الخلايا الجذعية لاصق في نتائج لوحة الماوس الدهون في تشكيل هياكل تشبه الغدد تحت المخاطية التي تظهر الشكل 4. وينظر في هذه الكتل حتى من دون تلطيخ H & E. هذه هي كروية ويمتلك التجويف المركزي. العديد من المقاطع العرضية يجب القيام بها من خلال لوحة الدهون حتى لا تفوت هذه الهياكل الظهارية.
الشكل 1. الهضم الإنزيمي للظهارة القصبة الهوائية. ويرد إزالة الخلايا الظهارية السطحية مع BLACويرد السهام ك، وإزالة الخلايا في القنوات الغدة تحت المخاطية مع السهام الخضراء. وتظهر القصبات المعري التي تكون مرئية بواسطة المجهر الضوئي بعد 30 دقيقة من عملية الهضم dispase وبعد 4 ساعات من الهضم pronase.
2A الرقم الأول. التدفق الخلوي للتعليق خلية واحدة إلى الأمام تظهر مبعثر ممثل والمخططات مبعثر الجانب من القصبات الماوس بعد تجريد سطح الظهارية. الثاني. ممثل FACS المؤامرات لTROP2 التعبير في الخلايا القناة من القصبات الماوس.
2B الرقم الأول. التدفق الخلوي للخلية واحدة من المعلقات ظهارة سطح جردت من ثلثي أقل اثنين من القصبة الهوائية الماوس تظهر مبعثر إلى الأمام وممثل الجانب مبعثر المؤامرات. الثاني. FACS نموذجية قطعة ITGA6 التعبير في سوrface ظهارة. ثالثا. آخر مؤامرة FACS ممثل الأمام والجانب مبعثر من ظهارة السطح مرة أخرى تظهر النابضة من السكان الخلايا القاعدية باللون الأخضر. رابعا. ITGA6 النموذجية وTROP2 معربا عن السكان الخلية باللون الأخضر.
الشكل 3. بالطبع وقت تطوير المجالات. A. المجالات لاصق. يجب أن تكون مرئية المجالات في matrigel بعد حوالي 1 أسبوع في الثقافة وتقريبا جميع كثيفة في المظهر. وينظر أيضا خلايا مفردة التي لا تشكل المجالات. (شريط النطاق = 50 ميكرون). B. المجالات بصل أكبر واللمعية في المظهر. وينظر أيضا خلايا مفردة التي لا تشكل المجالات. (شريط النطاق = 50 ميكرون).
الشكل 4. حقن الخلايا الجذعية لاصق في نتائج لوحة الماوس الدهون في تشكيل هياكل تشبه الغدد تحت المخاطية. ممثل الهياكلوتظهر في لوحة الدهون وتظهر بعض انتاج الميوسين (الضوء الأزرق) مع زرقة الألسيان شيف حمض الدوري وصمة عار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه التقنية لعزل الخلايا القاعدية والقناة من الشعب الهوائية من المهم لتحسين فهمنا للإصلاح والتجديد الهوائية وأمراض الشعب الهوائية. التقنيات الموضحة هنا تشمل على بعد خطوات قليلة حرجة. الأول هو الأمثل فترة الهضم الأنزيمي. والثاني هو إنشاء خلية واحدة من خلال التعليق المسلسل الركض مع الإبر سبر أعلى تدريجيا لمنع قص الخلية ولكن لتفريق كتل الخلايا. والثالث هو تحليل FACS، والنابضة من خلايا الأجسام المضادة مع المناسبة.
وبعض الانزيمات لسطح قطاع الحواتم، مثل ITGA6 وNGFR، واحدة ممكن التعديل هو تغيير البروتوكولات الهضم انزيم لتجنيب الحواتم. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لعزل الخلايا البطانية القصبة الهوائية أو الخلايا الوسيطة الأخرى عن طريق تغيير الأجسام المضادة المحددة على السطح علامات على أنواع الخلايا.
القيود المفروضة على فصل الخلايا القاعدية والقناةويرتبط نقص الحالي للعلامة السطحية للتمييز خلايا القناة من الخلايا القاعدية والحاجة إلى تجريد سطح الظهارية وإمكانية ترك بعض الخلايا القاعدية وراء. وتحديد المستقبل من علامات سطح الخلايا خصيصا لاصق جعل هذه العملية أسهل وتغني عن الحاجة إلى تجريد الظهارية السطحية. فإنه سيتم أيضا ينفي الحاجة إلى استخدام أقل من ثلثي القصبة الهوائية لنقي الاستعدادات الخلايا القاعدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نعترف الخلايا الجذعية واسع FACS مركز البحوث وأشكر خصوصا جيسيكا سكولز وكودريا فيليسيا لمساعدتهم مع الفرز الخلية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل CIRM RN2-00904-1، K08 HL074229، وجمعية أمراض الصدر الأميركية / COPD مؤسسة ATS-06-065، المؤسسة المعنية وUCLA جونسون المركز الشامل للسرطان الصدر SPORE الأورام السرطانية برنامج / الرئة، سرطان في جامعة كاليفورنيا البحث جنة التنسيق وهازن غوين الكرز التذكارية المختبرات (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 | |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 | |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI | |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 | |
Table 1. Complete media components. |
|||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea. |
|||
References
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
