Summary
Her viser vi vores protokol til isolering af basale og submukøs kirtel kanalen celler fra mus luftrør. Vi demonstrerer også metoden til injektion af stamceller i den dorsale muse fedtpuden at skabe en
Abstract
Den store luftveje er direkte i kontakt med miljøet, og derfor modtagelige for skade fra toksiner og smitstoffer, som vi ånde i 1. Den store luftveje kræver derfor en effektiv reparation mekanisme til at beskytte vores kroppe. Denne reparation proces sker fra stamceller i luftveje og isolere disse stamceller fra luftvejene er vigtigt for at forstå mekanismerne af reparation og regenerering. Det er også vigtigt for forståelsen af unormal reparation, kan føre til luftvejssygdomme 2. Målet med denne fremgangsmåde er at isolere en hidtil ukendt stamcellepopulation fra muse tracheale submukøse kirtel kanaler, og at placere disse celler i in vitro og in vivo modelsystemer til at identificere mekanismerne for reparation og regenerering af de submukøse kirtler 3. Denne produktion viser fremgangsmåder, der kan anvendes til isolering og assay kanalen og basale stamceller fra store luftveje 3. Denne måde kan viat undersøge sygdomme i luftvejene, såsom cystisk fibrose, astma og kronisk obstruktiv lungesygdom. I øjeblikket er der ingen fremgangsmåder til isolering af submukøse kirtel kanalen celler, og der er ingen in vivo modeller til at studere regeneration af submukøse kirtler.
Protocol
Oversigt over Steps
1. Dissektion af trachea
2. Rengøring luftrøret og skære det
3. Enzymfordøjelse og forarbejdning til enkelt cellesuspension
4. Farvning for FACS og sortering
5. Behandling sorterede celler til in vivo-og in vitro-modeller
1. Dissektion af Luftrør
- Aflive musen med en intraperitoneal injektion af 0,1 mg/0.2 cc af pentobarbital.
- Skær åbne bugvæggen, og flytte tarmene til side for at blotlægge den abdominale aorta og derefter dissekere den.
- Åbne kisten ved at skære gennem membranen og forreste brystvæg på begge sider for at blotlægge hjertet og lungerne. Fortsætte med at skære op i halsen fjerne fedt og spytkirtler at blotlægge trachea.
- Fjern thymus og skær lungen off dens forbindelser under og bag. SEPARspiste trachea fra spiserøret ved at indsætte en pincet mellem dem derefter skæres i trachea ved dets øvre meste over dens forbindelse med strubehovedet. Hold derefter luftrøret med en pincet og dissekere det fra dens fastgørelse og fortsætte nedad for at fjerne det med hjerte og lunger en-blok. Skær væk hjertet og lungerne nær hilum at omfatte det meste af højre og venstre main bronkier.
- Anbring trachea i en lille petriskål indeholdende indsamling medium på is.
2. Rengøring luftrøret og skære det
- Under dissektionsmikroskop, bruge meget fin spids pincet (nr. 5) og Vannas Tubingen sakse (FST 15.003-08 finescience.com) til at rense luftrøret fra alle de andre væv, der er knyttet til den. Dette omfatter: lymfeknuder, tilbagevendende larynx nerve, fedt, skjoldbruskkirtel og resterende pulmonale kar. Den øverste del af luftrøret kræver særlig opmærksomhed, for at fjerne de store larynx brusk uden at kompromittere den største flok af SMGder indgives mellem cricoid brusk og den første trakeal bruskagtig ring (C1) 4.
- Skær luftrøret i den øvre del og den nedre del mellem C4 og C5 og derefter skåret op begge dele gennem hulrummet i luftrøret.
3. Enzymfordøjelse og forarbejdning til enkelt cellesuspension (SCS)
- Inkuber den nederste del af trachea i 1 ml 16 U dispase i et Eppendorf-rør ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter, som tidligere beskrevet 5. Derefter tilsættes 0,5 mg / ml DNase I i DMEM i yderligere 20 min ved stuetemperatur.
- Fjern de fordøjede luftrør i frisk indsamling medium i en steril petriskål, og fratage overfladeepithelet under dissektionsmikroskop. Anvend en pipette for at overføre medium indeholdende den afisolerede epitel til et 50 ml konisk rør.
- Spin ned strippet epitel ved 1.000 xg ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 0,1% trypsin / EDTA og inkuberes under omrystning the røret i en 37 ° C rysteinkubator (200 rpm) i 30 min. Efter inkuberingen under anvendelse af en 1000 pi tip pipetteres op og ned for at opbryde klumper og dannelse af en enkelt cellesuspension.
- Anbring den øverste trachea i et konisk rør indeholdende 1 ml 0,15% pronase. Derefter inkuberes ved 4 ° C i 4 timer.
- Forsigtigt Vortex røret og derefter placere luftrøret i frisk indsamling medium og bekræft under dissektionsmikroskop, at der er fuldstændig adskillelse af overfladen epitel (SE).
- Hak luftrøret med en fin saks til at åbne op for SMG rum og derefter inkubere i en time mere i pronase ved RT med langsom rystning.
- Spin ned den tracheale væv, fjern pronase, tilsæt 0,1% trypsin / EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter under omrystning som ovenfor.
- Passage de spaltede celler, klumper og de resterende klumper af kirtler gennem 20G, 23G og 26G nåle under anvendelse af en 10 ml sprøjte. Gentag de passage flere gange med hver nål størrelse førtræder tilbage. Nu bør de fleste celler være i et SCS.
- Filtreres suspensionen gennem en 40 uM si vask derefter sien og spin ned cellerne. Så rekonstruere cellerne i passende volumen af medium, tælle cellerne og gå straks til FACS farvning og sortering. Lad ikke cellerne i 4 ° C eller på is i flere timer, fordi vi fandt, at dette påvirker levedygtigheden og alvorligt reducerer kuglen danner effektiviteten.
4. Farvning for FACS og sortering
- Tag nok celler til fremstilling af de ufarvede og enkelt farvede kompensation rør derefter plet resten af cellerne med primære antistoffer, ged Trop2 og rotte ITGA6, i 15 minutter ved stuetemperatur. Vask derefter med PBS eller indsamle medium, remover supernatanten meget omhyggeligt og bryde cellepelleten.
- Stain med det passende sekundære antistof, inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 10 minutter, vask og fjernelse af supernatant og derefter bryde pelletten.
- På FACSARIA, efter at justere din spænding og kompensation, gate ud af ruinerne, meget små celler, celle dubletter og døde celler. Derefter bør de fleste celler fra SE være TROP2 positiv mens 20-50% af SMG celler vil være TROP2 + 6.
- Indstil din sortering gate for Trop2 + ITGA6 +-celler fra SE (basale celler) og for Trop2 + celler (+ /-ITGA6 positive celler) fra SMG (kanal celler).
5. Forarbejdning sorterede celler til: in vitro kultur og in vivo-model
5,1 In vitro sfære danner 5-9 kultur
- Bland 100 gl "vækstfaktor reduceret Matrigel" med 100 ul komplet medium 10,11 (se tabel 1) indeholdende op til 50.000 sorterede celler derefter sætte denne blanding i det øvre kammer af en 24-brønds trans-brønd. Derefter sættes 400 pi af komplet medium i nedre kammer og inkuber ved 37 ° C. Skift medium i nedre kammer hver anden dag, og der tilsættes yderligere 100 ul Matrigelhver uge eller tidligere, hvis det bliver tynd.
5,2 In vivo-model
- Rekonstituere det sorterede cellepellet i komplet medium blandet 1:1 med Matrigel i en koncentration på 5.000-10.000 celler pr 50 pi.
- Bedøver de modtagende C57/BL6 mus. Administrere Carprofen (5 mg / kg) subcutaenously som et analgetikum. Steriliser og barbere deres rygge derefter foretage en central langsgående hud indsnit i den øvre ryg. Incisionen skal være stort nok til at identificere fedtpuden injektionsstedet og blæren der danner efter injektion. Brug den stumpe side af saksen til at udvide poser mellem huden og bagsiden af brystvæggen på begge sider for at maksimere adgangen og visualisering.
- Identificer den mediale kant af scapula ved at skubbe musen forlem op og bagud for at se scapula bevægelse. Tag 50 pi af cellesuspensionen i en 300 gl BD insulinsprøjte og indsprøjtes i fedtpuden lige medialt til bovbladet og lateralt i forhold tilryghvirvler. Du bør være i stand til at se et bleb ellers du er for dybt. Gentag det samme på den anden side så klip eller sy hudindskæring. Tjek mus og give Carprofen (5 mg / kg, SC) én gang dagligt i 48 timer.
- Efter 3 uger aflive mus med pentobarbatol (0,1 mg/0.2 cc, IP), skal du åbne huden som ovenfor, og dissekere hele fedtpude fra begge sider med en sikkerhedsmargen til at undgå mangler nogen væv struktur, der kunne have dannet og forlænget rundt. Fix i PFA og embed i paraffin 12. Meget stor omhu skal anvendes under trimning og skære blokken til ikke at omgå eller overse en struktur. Den bedste praksis er at trimme 40 pm en gang og derefter klippe en 4 um skive, placere den på et objektglas og undersøges det under mikroskop for at bekræfte, om der er nogen "epiteliale strukturer" i denne del af blokken eller ej. Hvis der ikke er set noget, så trimme en gang mere, og gentage dette trin.
6. Repræsentative resultater
Stripping af muse luftrør vil resultere i en blottet luftrør, der er synlige ved lysmikroskopi som vist i figur 1A. 1B viser brightfield afbildning af et luftrør efter epitel stripning med submukøse kirtler frigøres fra væv og ligner drueklaser.
Pronase fjerner ITGA6 epitop og derfor de TROP2 kanal celler ikke kan adskilles i ITGA6 + og - populationer. Imidlertid dispase, som bevarer ITGA6 epitopen, fordøjer hele overfladen epitel og kanalen celler, selv med meget korte inkubationstider, og kan derfor ikke anvendes til at adskille kanalen fra basalceller 3. Flowcytometri af enkeltcelle-suspensioner bør vise Forward Scatter og side scatter plots, der er repræsenteret i figur 2A. God separation af kanalen celler fra resten hvis luftrør celler skal ses med det Trop2 antistof i flowcytometri for fluorescerende aktiveret celle-sorting (FACS) som vist i figur 2B. Sfærer skal være synlige i Matrigel efter ca 1 uge i kultur og er tætte i udseende som vist i figur 3.. Effektiviteten ved denne fremgangsmåde er i størrelsesordenen 1-2% og enkelte celler vil stadig være til stede i Matrigel og sandsynligvis repræsenterer celler fra de submukøse kirtel kanaler, der ikke besidder evne til selvfornyelse. Injektion af kanalen stamceller i musen fedtpude resulterer i dannelsen af submukøse kirtel-lignende strukturer, der er vist fig. 4. Disse ses i blokkene selv uden H & E farvning. Disse er sfæriske og har en central lumen. Mange tværsnit skal gøres gennem den fedtpude for ikke at gå glip af disse epiteliale strukturer.
Fig. 1. Enzymatisk fordøjelse af tracheal epitel. Fjernelse af overflade-epitelceller er vist med black pile, fjernelse af celler i de submucosale kirtel kanaler er vist med grønne pile. Nøgne luftrør, der er synlige ved lysmikroskopi er vist efter 30 minutters dispase fordøjelse og efter 4 timer af pronase-fordøjelse.
Figur 2A. In. Flowcytometri af de enkelte cellesuspensioner viser repræsentative forward scatter og sidespredning plots fra muse luftrør efter overfladen epitel stripning. ii. Repræsentative FACS grunde til TROP2 ekspression i kanal celler fra mus luftrør.
Figur 2B. In. Flowcytometri af de enkelte cellesuspensioner fra strippet overflade epitel i de nederste to tredjedele af muse trachea viser repræsentative fremadspredning og side scatter plots. ii. Typiske FACS plot af ITGA6 ekspression i surface epitel. iii. En anden repræsentativ FACS plot af fremad og sidespredning fra overfladen epitel viser tilbage gating af den basale cellepopulation i grønt. iv. Typisk ITGA6 og TROP2 udtrykke cellepopulation i grønt.
Figur 3. Tidsforløb af udviklingen af kugler. A. Duct kugler. Spheres skal være synlige i Matrigel efter ca 1 uge i kultur og næsten alle er tæt i udseende. Enkelte celler, der ikke danner kugler ses også. (Skala bar = 50 um). B. Basal kugler er større og luminal i udseende. Enkelte celler, der ikke danner kugler ses også. (Skala bar = 50 um).
Fig. 4. Injektion af kanalen stamceller i musen fedtpude resulterer i dannelsen af submukøse kirtel-lignende strukturer. Repræsentative strukturerer vist i fedtpuden og nogle er vist producerer mucin (lyseblå) med Alcian Blue Periodic Acid Schiff stain.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknik til at isolere kanalen og basale celler fra luftvejene er vigtig for at forbedre vores forståelse af luftvejs reparation og regenerering og luftvejs-sygdomme. De beskrevne teknikker her omfatte et par kritiske trin. Den første er den optimeret enzymatisk fordøjelse periode. Den anden er skabelsen af en enkelt celle suspension via seriel passage med progressivt højere gage nåle til at forhindre cell forskydning, men at bryde op celleklumper. Den tredje er FACS-analyse, og gating af celler med egnede antistoffer.
Som nogle af de enzymer båndoverfladen epitoper, ligesom ITGA6 og NGFR, er en mulig modifikation at ændre enzymfordøjelse protokoller for at skåne epitoper. Denne protokol kan også anvendes til isolering af tracheale endotelceller eller andre mesenchymal-celler ved at ændre de specifikke antistoffer mod overflademarkører på celletyper.
Begrænsningerne ved adskillelse af kanalen og basale cellerer relateret til vores nuværende mangel på en overflademarkør at skelne kanal celler fra basale celler og behovet for overfladen epitelvæv stripning og muligheden for at lade nogle basale celler bagud. Fremtidig identifikation af overflademarkører specielt til kanalen celler vil gøre denne proces nemmere og overflødiggøre behovet for overfladen epitel selskabstømning. Det vil også ophæve behovet for at anvende de nederste to tredjedele af trachea for rene basalcelle præparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende de overordnede Stem Cell Research Center FACS og især takke Jessica Scholes og Felicia Codrea for deres hjælp med cellesortering. Arbejdet blev finansieret af CIRM RN2-00.904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / KOL Foundation ATS-06-065, The Concern Foundation, The UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / Lung Cancer SPORE, University of California Cancer Forskning Samordningsudvalg og Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 | |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 | |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI | |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 | |
Table 1. Complete media components. |
|||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea. |
|||
References
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
