Summary
Hier laten we zien ons protocol voor isolatie van basale en submucosale klier kanaal cellen van de muis luchtpijpen. We tonen ook aan de methode van het injecteren van stamcellen in het dorsale muis vetkussentje om een te creëren
Abstract
De grote luchtwegen rechtstreeks in contact met de omgeving en dus gevoelig voor schade van toxines en infectieuze agentia die we inademen in 1. De grote luchtwegen vereisen daarom een efficiënt herstelmechanisme ons lichaam beschermen. Dit proces vindt reparatie van stamcellen in de luchtwegen en het isoleren van stamcellen die uit de luchtwegen belangrijk voor het begrijpen van de mechanismen van herstel en regeneratie. Het is ook belangrijk voor het begrijpen van abnormale reparatie die kan leiden tot aandoeningen van de luchtwegen 2. Het doel van deze methode is om een nieuwe stamcelpopulatie isoleren van de muis trachea submucosale klier kanalen en deze cellen plaats in in vitro en in vivo modelsystemen de mechanismen van herstel en regeneratie van de submucosale klieren 3 identificeren. Deze productie toont methoden die kunnen worden gebruikt voor het isoleren en assay het kanaal en basale stamcellen uit de grote luchtwegen 3. Hierdoor kunnen weom ziekten van de luchtwegen, zoals cystische fibrose, astma en chronische obstructieve pulmonaire ziekte te bestuderen. Momenteel zijn er geen methoden voor het isoleren van submucosale klier duct cellen en er zijn geen in vivo modellen voor de regeneratie van submucosale klieren bestuderen.
Protocol
Overzicht van stappen
1. Dissectie van trachea
2. Reiniging luchtpijp en snijden
3. Enzymdigestie en verwerking tot enkele celsuspensie
4. Kleuring voor FACS sortering en
5. Verwerking gesorteerde cellen in vivo en in vitro modellen
1. Dissectie van Luchtpijp
- Euthanaseren de muis met een intraperitoneale injectie van 0,1 cc mg/0.2 van pentobarbital.
- Snij de buikwand, en verplaats de darmen naar de zijkant om de abdominale aorta vervolgens bloot te leggen en te ontleden.
- Open de kist door te snijden door het diafragma en de voorste borstwand aan beide zijden naar het hart en de longen bloot te leggen. Ga verder snijden in de hals het verwijderen van vet-en speekselklieren aan de luchtpijp bloot te leggen.
- Verwijder de thymus en snijd de longen uit zijn verbindingen onder en achter. Separat de trachea van de slokdarm door met een forceps tussen knip de trachea op haar bovenste gedeelte boven de verbinding met de larynx. Houd vervolgens de luchtpijp met een tang en ontleden het van zijn gehechtheid en blijven naar beneden om het te verwijderen met het hart en de longen en-blok. Weggesneden hart en longen nabij de navel de meeste rechter en linker hoofdbronchi omvatten.
- Plaats de trachea in een kleine petrischaal met verzamelen medium op ijs.
2. Reiniging Trachea en snijden
- Onder de dissectiemicroscoop, maken gebruik van zeer fijne punt pincet (nr. 5) en Vannas Tübingen schaar (FST 15.003-08 finescience.com) om de luchtpijp te reinigen van alle andere weefsels die eraan verbonden zijn. Dit omvat: lymfeklieren, recurrens, vet, schildklier en de resterende longvaten. Het bovenste deel van de trachea heeft speciale aandacht voor de grote laryngale kraakbeen te verwijderen zonder de grootste stel SMGdat wordt ingediend tussen de cricoid kraakbeen en de eerste tracheale kraakbenige ring (C1) 4.
- Snijd de trachea in het bovenste deel en het onderste deel tussen C4 en C5 en opengesneden beide delen door het lumen van de trachea.
3. Enzym Spijsvertering en Verwerking tot enkele celsuspensie (SCS)
- Incubeer het onderste deel van de trachea in 1 ml 16 U dispase in een Eppendorf buis bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 min, zoals eerder beschreven 5. Voeg 0,5 mg / ml DNase I in DMEM nog 20 min bij RT.
- Verwijder het verteerde luchtpijpen in de frisse verzamelen medium in een steriele petrischaal, en strip de oppervlakte-epitheel onder de dissectiemicroscoop. Gebruik een pipet om het medium dat de gestripte epitheel aan een 50 ml conische buis brengen.
- Spin down de gestripte epitheel bij 1.000 xg bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en voeg 0,1% trypsine / EDTA en incubeer onder schudden ee buis in een 37 ° C incubator schudden (200 rpm) gedurende 30 minuten. Na de incubatie met een tip 1000 pi, op en neer pipetteren te breken klonten en een enkele celsuspensie te vormen.
- Plaats de bovenste trachea in een conische buis met 1 ml van 0,15% pronase. Vervolgens incuberen bij 4 ° C gedurende 4 uur.
- Voorzichtig vortexen de buis en vervolgens de luchtpijp te plaatsen in verse verzamelen medium en bevestigen onder de dissectiemicroscoop dat er volledige onthechting van het oppervlakte-epitheel (SE).
- Hak de luchtpijp met een fijne schaar om het openstellen van de SMG compartimenten en vervolgens nog een uur in pronase incuberen bij KT met langzame schudden.
- Spin down de tracheaweefsel, verwijder de pronase, voeg 0,1% trypsine / EDTA en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min met schudden als hierboven.
- Passage de gedigereerde cellen klonten en eventueel overgebleven stukjes klieren door 20G, 23G en 26G naalden met een 10 ml spuit. Herhaal de passage meerdere keren met elkaar nld voordataftreden. Nu moet de meeste cellen in een SCS.
- Filter de suspensie door een 40 uM zeef Was vervolgens de zeef en spin down de cellen. Vervolgens reconstitueren de cellen in de juiste hoeveelheid medium, tellen de cellen en zich onmiddellijk aan FACS kleuring en sortering. Laat cellen in 4 ° C of op ijs gedurende enkele uren omdat we vonden dat de levensvatbaarheid ernstig aantast en vermindert het gebied vormen efficiency.
4. Kleuring voor FACS en sorteren
- Neem voldoende cellen voorbereidende ongekleurd en gekleurd enkele compensatie buizen dan vlek rest van de cellen met primaire antilichamen, en geit Trop2 rat ITGA6, gedurende 15 min bij RT. Daarna wassen met PBS of het verzamelen van medium, remover het supernatant zeer zorgvuldig en breek de cel pellet.
- Vlek met de geschikte secundaire antilichaam Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 min, wassen en verwijderen supernatant en pellet breken.
- Op FACSARIA, na het aanpassen van uw spanning en compensatie, poort van het puin, zeer kleine cellen, wambuizen en dode cellen. Daarna moet de meeste cellen van het SE TROP2 positief terwijl 20-50% van SMG cellen zullen TROP2 + 6.
- Stel uw sorteren poort voor Trop2 + ITGA6 + cellen uit het ZO (basale cellen) en voor Trop2 + cellen (+ /-ITGA6 positieve cellen) van SMG (kanaal cellen).
5. Verwerking voor gesorteerde cellen: in vitro cultuur en in vivo Model
5.1 In vitro bol vormen vijf-negen cultuur
- Meng 100 pl "Growth Factor verminderd Matrigel" met 100 ul compleet medium 10,11 (zie tabel 1) met tot 50.000 gesorteerde cellen vervolgens dit mengsel zet in de bovenste kamer van een 24-well trans-well. Vervolgens 400 ul volledig medium in onderkamer en incuberen bij 37 ° C. Wijziging medium in Tweede Kamer om de andere dag en voeg extra 100 ul van Matrigelelke week of zoveel eerder als het wordt dun.
5.2 In vivo model
- Los het gesorteerd celpellet in compleet medium 1:1 gemengd met matrigel bij een concentratie van 5.000-10.000 cellen per 50 ul.
- Verdoof de ontvanger C57/BL6 muizen. Dien Carprofen (5 mg / kg) subcutaenously als analgeticum. Steriliseren en scheren hun rug maak dan een centrale longitudinale incisie in de huid in de bovenrug. De incisie moet groot genoeg zijn om de vetkussentje injectieplaats en de bleb die zich vormt na injectie identificeren. Gebruik de botte kant van de schaar om zakjes tussen de huid en de achterkant van de borstwand aan beide zijden van de toegang en visualisatie te maximaliseren verbreden.
- Identificeer de mediale rand van het schouderblad door op de muis voorpoot omhoog en naar achteren om de scapula bewegende zien. Neem 50 pi van de celsuspensie in een 300 pl BD insulinespuit en injecteren in de vetkussentje net mediaal van de scapula en lateraalde wervels. Je moet in staat zijn om een blaar anders ben je te diep te zien. Herhaal hetzelfde aan de andere kant dan clip of steek de huid incisie. Bekijk muizen en geven Carprofen (5 mg / kg, SC) eenmaal daags gedurende 48 uur.
- Na 3 weken, euthanaseren muizen met pentobarbatol (0,1 mg/0.2 cc, IP), open de huid zoals hierboven beschreven en ontleden de hele vetkussentje aan beide zijden met een veiligheidsmarge om te voorkomen dat niet aan een of weefsel structuur die zou kunnen hebben gevormd en rond verlengd. Fix in PFA en embed in paraffine 12. Uiterst voorzichtig te worden toegepast bij het trimmen en snijden het blok niet te omzeilen of kijken uit over een structuur. De beste praktijk is tot 40 pm trimmen eenmaal knip dan een 4 micrometer slice, het op een glasplaatje te plaatsen en deze onder de microscoop om te controleren of er nog "epitheliale structuren" in dit deel van het blok of niet te onderzoeken. Als er niets gezien, en knip een keer en herhaal deze stap.
6. Representatieve resultaten
Stripping van de muis trachea zal resulteren in een trachea blootgelegd die zichtbaar licht microscopie zoals getoond in figuur 1A. Figuur 1B toont de brightfield aanzicht van een trachea na epitheliale strippen met submucosale klieren worden vrijgesteld van de weefsels en lijken druiventrossen.
Pronase verwijdert de ITGA6 epitoop en dit is de reden waarom de TROP2 kanaal cellen kunnen niet worden gescheiden in ITGA6 + en - populaties. Echter, dispase, die ITGA6 epitoop behoudt, verteert de oppervlakte-epitheel en de leiding cellen zelfs met zeer korte incubatietijden en kan daarom niet worden gebruikt om kanaal scheiden van basale cellen 3. Flowcytometrie van de enkele cel suspensies moeten tonen voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing percelen die worden weergegeven in Figuur 2A. Goede scheiding van duct cellen van de rest als de tracheale cellen worden gezien met de Trop2 antilichaam flowcytometrie voor fluorescentie-geactiveerde cel sorting (FACS) zoals in figuur 2B. Bollen zichtbaar moet in de Matrigel na ongeveer 1 week in cultuur en in dichte uiterlijk als getoond in figuur 3. De efficiëntie van dit proces is de orde van 1-2% en enkele cellen nog aanwezig zijn in de Matrigel en vertegenwoordigen waarschijnlijk cellen van de submucosale klier kanalen die niet over het vermogen tot zelfvernieuwing. Injectie van duct stamcellen in de muis vetkussentje resulteert in de vorming van submucosale klier-achtige structuren die worden weergegeven in Figuur 4. Deze worden gezien in de blokken ook zonder H & E kleuring. Deze zijn bolvormig en hebben een centrale lumen. Veel doorsneden moeten worden gemaakt door middel van het vet pad om te voorkomen dat deze epitheliale structuren missen.
Figuur 1. Enzymatische digestie van tracheale epitheel. Verwijderen van oppervlakte epitheelcellen wordt met black pijlen, verwijdering van cellen in de submucosale klier kanalen wordt met groene pijlen. Denuded luchtpijpen die zichtbaar door lichtmicroscopie getoond na 30 min dispase spijsvertering en na 4 uur van pronase digestie.
Figuur 2A. I. Flowcytometrie van de enkele cel suspensies die representatief voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing percelen van muis luchtpijpen na oppervlakte epitheel strippen. ii. Vertegenwoordiger FACS percelen voor TROP2 expressie in het kanaal cellen van de muis luchtpijpen.
Figuur 2B. I. Flowcytometrie van de enkele cel suspensies van ontdaan oppervlakte-epitheel van de onderste twee derde van de muis trachea met representatieve voorwaartse verstrooiing en aan de zijkant puntgrafieken. ii. Typische FACS perceel van ITGA6 expressie in surface epitheel. iii. Een andere vertegenwoordiger FACS perceel van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing van oppervlakte-epitheel toont terug gating van de basale cel populatie in het groen. iv. Typische ITGA6 en TROP2 expressie brengende cel populatie in het groen.
Figuur 3. Tijdsverloop van de ontwikkeling van bolletjes. A. Duct bollen. Spheres moet zichtbaar zijn in de Matrigel na ongeveer 1 week in de cultuur en bijna alle zijn dicht in verschijning. Enkele cellen die niet tot bolletjes worden ook gezien. (Schaal bar = 50 pm). B. Basal bollen zijn groter en luminale in uiterlijk. Enkele cellen die niet tot bolletjes worden ook gezien. (Schaal bar = 50 pm).
Figuur 4. Injectie duct stamcellen in de muis vetkussentje resulteert in de vorming van submucosale klier-achtige structuren. Representatieve structurenwordt in vetkussentje en sommige zijn vertegenwoordigd produceren mucine (lichtblauw) met Alcian blue Periodic Acid Schiff kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze techniek kanaal en basale cellen van de luchtwegen isolaat belangrijk voor een beter begrip van de luchtwegen en herstel en regeneratie van de luchtwegen. De hier beschreven technieken zijn een paar kritische stappen. De eerste is de geoptimaliseerde enzymatische vertering periode. De tweede is het creëren van een enkele celsuspensie door middel van seriële passage met steeds hogere gage naalden naar cel knippen te voorkomen, maar te breken celklonten. De derde is de FACS analyse en gating van cellen met geschikte antilichamen.
Aangezien enkele van de enzymen bandoppervlak epitopen, zoals ITGA6 en NGFR, een mogelijke modificatie van de enzymdigestie protocollen veranderen om de epitopen sparen. Dit protocol kan ook gebruikt worden om tracheale endotheelcellen of andere mesenchymale cellen te isoleren door het veranderen van specifieke antilichamen tegen markers oppervlak celtypen.
De beperkingen van de scheiding van kanaal en basale cellenbetrekking op onze huidige gebrek aan een oppervlak marker duct cellen van basale cellen en de noodzaak van epitheliale oppervlak strippen en de mogelijkheid waardoor sommige basale cellen achter onderscheiden. Toekomstige identificatie van oppervlaktemerkers specifiek voor duct cellen zal dit proces eenvoudiger en overbodig oppervlak epitheliale strippen. Het zal ook de behoefte teniet aan de onderste tweederde van de trachea gebruiken pure basale celpreparaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen de globale Stem Cell Research Center FACS erkennen en vooral Jessica Scholes en Felicia Codrea bedanken voor hun hulp bij celsortering. Het werk werd gefinancierd door CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / COPD Stichting ATS-06-065, The Concern Foundation, De UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / Longkanker SPORE, de Universiteit van Californië kanker Onderzoek Coordinating Committee en de Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 | |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 | |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI | |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 | |
Table 1. Complete media components. |
|||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea. |
|||
References
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
