Summary
כאן אנו מראים הפרוטוקול שלנו לבידוד של תאי צינור בלוטה הבזליים וקנה נשימת submucosal מעכבר. גם אנחנו מדגימים את השיטה של הזרקת תאי גזע לכרית השומן הגבה עכבר כדי ליצור
Abstract
דרכי האוויר הגדולות הן ישירות במגע עם הסביבה ולכן רגישות לפגיעה מרעלים וחומרים מזהמים שאנו נושמים ב1. דרכי האוויר הגדולות ולכן דורשות מנגנון תיקון יעיל כדי להגן על גופנו. תהליך תיקון זה מתרחש מתאי גזע בדרכי אוויר ובידוד תאי גזע מדרך הנשימה הוא חשוב להבנת המנגנונים של תיקון והתחדשות. זה גם חשוב להבנת תיקון חריג שעלול להוביל למחלות דרך נשימת 2. המטרה של שיטה זו היא לבודד את אוכלוסיית תאי גזע רומן מצינוריות בלוטת submucosal קנה הנשימה של העכבר ולמקם את התאים האלה במבחנה במערכות מודל vivo לזהות את המנגנונים של תיקון והתחדשות של בלוטות submucosal 3. ייצור זה מציג שיטות שיכולות לשמש לבידוד ובדיקת תאי הגזע הדביקים ובסיסיים מ3 דרכי האוויר הגדולות. זה יאפשר לנוללמוד מחלות של דרך הנשימה, כגון סיסטיק פיברוזיס, אסתמה ומחלת ריאות חסימתית כרונית. נכון לעכשיו, אין שיטות לבידוד של תאי צינור בלוטה submucosal ואין במודלי vivo ללמוד התחדשות של בלוטות submucosal.
Protocol
קווי מתאר של צעדים
1. נתיחה של קנה נשימה
2. ניקוי קנה נשימה וחותך אותו
3. אנזים עיכול ועיבוד לתוך השעית תא בודדה
4. הכתמה לFACS ומיון
5. עיבוד תאים ממוינים לin vivo ו במודלים חוץ גופייה
1. נתיחה של קנה נשימה
- להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 0.1 mg/0.2 סמ"ק של פנטוברביטל.
- גזור לפתוח את דופן הבטן, ולהעביר את המעיים לצד לחשוף את אב העורקים בבטן ולאחר מכן לנתח את זה.
- פתח את החזה על ידי חיתוך דרך הסרעפת ובית חזה קדמי בשני הצדדים כדי לחשוף את הלב וריאות. תמשיך לחתוך לתוך צוואר הסרת בלוטות שומן ורוק לחשוף את קנה הנשימה.
- הסר את התימוס ולחתוך את הריאות מהחיבורים שלו מתחת ומאחורי. Separאכלתי את קנה הנשימה מהוושט על ידי החדרתו מלקחיים ביניהם ואז לחתוך את קנה הנשימה בחלק העליון ביותר שלה מעל החיבור שלה עם הגרון. לאחר מכן החזק את קנה הנשימה עם מלקחיים ולנתח את זה מהדבקות וממשיך כלפי מטה כדי להסיר אותו עם הלב וריאות en-בלוק. לחתוך את הלב וריאות בסמוך לhilum לכלול את רוב הסמפונות העיקרית ימין ושמאל.
- הנח את קנה הנשימה בצלחת פטרי קטנה המכילה איסוף בינוני על קרח.
2. ניקוי קנה נשימה וחיתוך זה
- תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים עדינים מאוד (נקודת מס '5) ומספרי טובינגן Vannas (15003-08 finescience.com FST) כדי לנקות את קנה נשימה מכל הרקמות האחרות שמחוברות אליו. זה כולל: בלוטות הלימפה, עצב בגרון חוזר ונשנה, שומן, בלוטת תריס וכלי ריאה נותרת. חלק העליון של קנה הנשימה זקוק לתשומת לב מיוחדת, כדי להסיר את סחוסי הגרון הגדולים מבלי להתפשר על החבורה הגדולה של SMGשנטוע בין סחוס cricoid והצלצול הראשון קנה נשימת הסחוסים (C1) 4.
- חותך את קנה הנשימה בחלק העליון וחלק התחתון בין C4 וC5 ולאחר מכן לחתוך את שני חלקים פתוחים בלום של קנה הנשימה.
3. אנזים עיכול ועיבוד להשעית תא בודדה (SCS)
- דגירה את החלק התחתון של קנה הנשימה ב1 מ"ל של dispase 16 U בצינור אפנדורף בטמפרטורת חדר (RT) למשך 30 דקות, כפי שתוארו בעבר 5. ואז להוסיף 0.5 מיליליטר DNase אני בDMEM מ"ג / ל20 דקות נוספות בRT.
- הסר את מעוכלת אל קנה הנשימה בינונית איסוף טרי בצלחת פטרי סטרילית, ולהפשיט אפיתל המשטח תחת מיקרוסקופ לנתח. השתמש פיפטה להעביר במדיום המכיל אפיתל הופשט לצינור 50 מיליליטר חרוטים.
- ספין למטה אפיתל הופשט ב1000 XG ב 4 ° C. הסר את supernatant, ולהוסיף 0.1% טריפסין / EDTA ולדגור בעוד רועד הצינור בדואר 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת (200 סל"ד) למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, באמצעות קצה μl 1000, פיפטה מעלה ומטה כדי לשבור את הגושים ויוצר השעית תא בודדה.
- הנח את קנה הנשימה העליון בצינור חרוטים המכיל 1 מ"ל של pronase 0.15%. אז לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
- מערבולת בעדינות את הצינור, ואז למקם את קנה הנשימה למדיום איסוף טרי ולאשר תחת מיקרוסקופ לנתח שיש ניתוק מוחלט של אפיתל פני השטח (SE).
- ברר בקנה הנשימה עם מספריים מצוינים לפתוח את מדורי SMG ואז דגירה במשך שעה אחת נוספת בpronase בRT עם רעד בגוף איטי.
- הספין למטה רקמות קנו נשימה, הסר pronase, מוסיף 0.1% טריפסין / EDTA ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם הרעד כאמור לעיל.
- מעבר תאים מתעכלים, גושים וכל נתחים נותרים של בלוטות באמצעות 20G, 23 ז ו26G מחטים באמצעות מזרק מ"ל 10. חזור מספר פעמי passaging עם כל גודל מחט לפניהתפטרותו. עכשיו, רוב התאים צריכים להיות בSCS.
- סנן את ההשעיה דרך מסננת מיקרומטר 40 לאחר מכן לשטוף את המסננת וספין למטה התאים. ואז לחדש את התאים בנפח המתאים של מדיום, ספירת התאים ולפנות מייד לFACS מכתים ומיון. אל תשאיר את תאים ב4 מעלות צלזיוס או על קרח לכמה שעות כי מצאו כי זה משפיע על הכדאיות וקשה מפחית את הכדור ויצר את היעילות.
4. הכתמה לFACS ומיון
- קח מספיק תאים להכנת צינורות הפיצויים המוכתמים בתוליים ואחת אז כתם שאר תאים עם נוגדנים ראשוניים, Trop2 עיזים וחולדות ITGA6, במשך 15 דקות בRT. לאחר מכן לשטוף עם PBS או איסוף בינוני, המסיר supernatant מאוד בזהירות ולשבור את התא הגלול.
- כתם עם הנוגדן המשני המתאים, דגירה בחושך בRT למשך 10 דקות, לשטוף ולהסיר את supernatant ולאחר מכן לשבור את הגלולה.
- על FACSARIA, לאחר התאמת המתח והפיצוי, שערכם את הפסולת, התאים קטנים מאוד, כפילויות סלולריות ותאים מתים. ואז, רוב התאים מSE צריכים להיות TROP2 חיוביים תוך 20-50% מתאי SMG יהיו TROP2 + 6.
- קבע שער מיונך לTrop2 + ITGA6 + תאים מSE (תאי בסיס) ולTrop2 + תאים (+ /-ITGA6 תאים חיוביים) מSMG (תאי צינור).
5. עיבוד תאים למיון: בתרבות מבחנה בדגם vivo
5.1 בתחום המבחנה להרכיב 5-9 תרבות
- מערבב 100 μl של "גורם גדילה מופחתת Matrigel" עם 100 μl של מדיום שלם 10,11 (ראה טבלה 1) המכיל עד 50,000 תאים ממוינים ואז לשים את התערובת בחדר העליון של טרנס גם 24 גם. ואז לשים 400 μl של מדיום מלא בחדר תחתון ולדגור על 37 ° C. שינוי הבינוני בחדר תחתון בכל יום אחר ולהוסיף 100 μl הנוסף של Matrigelכל שבוע או מוקדם יותר, אם זה הופך להיות רזה.
5.2 במודל vivo
- לשקם את התא מסודר בגלולה בינונית מלאה מעורבב עם 01:01 matrigel בריכוז של 5,000-10,000 תאים לכל 50 μl.
- הרדם את C57/BL6 עכברי נמען. לנהל carprofen (5 מ"ג / ק"ג) subcutaenously כמשכך כאבים. לעקר ולגלח את גבם לאחר מכן לבצע חתך בעור אורך מרכזי בגב העליון. החתך צריך להיות גדול מספיק כדי לזהות את אתר שומן משטח ההזרקה כמו גם בועה שיוצרת לאחר הזרקה. השתמש בצד הקהה של המספריים להרחיב שקיות בין העור והאחורי של קיר בית החזה בשני הצדדים על מנת למקסם את הגישה וויזואליזציה.
- זהה את הגבול המדיאלי של השכמה על ידי דחיפת forelimb העכבר למעלה ואחורה כדי לראות מרגש שכמה. קח 50 μl של השעית התא לתוך מזרק אינסולין BD μl 300 ולהזריק אותו בכרית השומן פשוט המדיאלי לעצם השכם ורוחב כדיהחוליות. אתה אמור להיות מסוגל לראות בועה אחרת אתה הוא עמוק מדי. חזור על אותו הדבר בצד אז קליפ או לתפור חתך בעור השני. בדקו עכברים ולתת carprofen (5 מ"ג / ק"ג, SC) פעם ביום למשך 48 שעות.
- לאחר 3 שבועות, להרדים עכברים עם pentobarbatol (0.1 mg/0.2 סמ"ק, ה-IP), לפתוח את העור כאמור לעיל ולנתח את כרית השומן השלמה משני הצדדים עם מרווח ביטחון כדי למנוע חסרים כל מבנה רקמות שיכולים להיוצר והוארך בסביבה. התקן בPFA ולהטביע בפרפין 12. זהירות רבה צריכה להיות מועסקת בזמירה וחיתוך הבלוק לא לעקוף או להתעלם מבנה. התרגול הטוב ביותר הוא לקצץ 40 מיקרומטר פעם אחת ואז לחתוך פרוסת 4 מיקרומטר, הנח אותו על משטח זכוכית ולבחון אותו במיקרוסקופ כדי לאשר אם יש "מבני אפיתל" בחלק זה של הגוש או לא. אם אין שום דבר לראות, ולאחר מכן לקצץ פעם נוספת ולחזור על שלב זה.
6. נציג תוצאות
Stripping קנה נשימה של העכבר יגרום לקנה נשימת נכרתים כי הוא גלוי במיקרוסקופ אור, כפי שמוצג באיור 1 א. 1B האיור מציג את נוף brightfield של קנה נשימה לאחר שבזז אפיתל בבלוטות submucosal ששוחררו מהרקמות והאשכולות דומים של ענבים.
Pronase מסיר epitope ITGA6 וזו הסיבה שלא ניתן להפריד את תאי TROP2 הצינור לתוך ITGA6 + ו - אוכלוסיות. עם זאת, dispase, המשמר את ITGA6 epitope, מעכל את כל פני שטח האפיתל ותאי הצינור אפילו עם זמני דגירה קצרים מאוד, ולכן לא ניתן להשתמש בו כדי להפריד בין צינור מתאי בסיס, 3. cytometry הזרימה של השעיות התא הבודדות צריך להראות קדימה חלקות פיזור פיזור וצד שמיוצגות באיור 2 א. הפרדה טובה של תאי צינור משאר אם תאי קנה הנשימה יש לראות עם נוגדן Trop2 cytometry זרימה לתא sorti פעיל ניאוןng (FACS) כפי שניתן לראות באיור 2B. Spheres צריך להיות גלוי בmatrigel לאחר כ 1 שבוע בתרבות ובצפוף במראה כפי שמוצג באיור 3. היעילות של התהליך הזה היא בסדר הגודל של 1-2% ותאים בודדים עדיין תהיה נוכח בmatrigel ועשוי לייצג תאים מצינוריות בלוטת submucosal שאין להן את יכולת התחדשות עצמית. הזרקה של תאי גזע לתוך צינור את תוצאות כרית שומן העכבר בהיווצרות של מבני submucosal בלוטה דמוית שמוצגים איור 4. אלה ראו בבלוקים גם ללא צביעת H & E. אלה הם כדוריים ובעלי לום מרכזי. חתכים רבים צריכות להתבצע באמצעות כרית השומן על מנת שלא לפספס את מבני אפיתל אלה.
איור 1. עיכול אנזימתי של האפיתל של קנה נשימה. הסרת תאי אפיתל פני שטח נראית עם blacחיצי k, הסרת תאים בצינוריות בלוטת submucosal מוצגים עם חיצים ירוקים. קנה נשימה ערומה הנראות על ידי מיקרוסקופ אור מוצגת לאחר 30 דקות של עיכול dispase ואחרי 4 שעות של עיכול pronase.
איור 2 א. אני. cytometry זרימה של השעיות התא הבודדות המראות פיזור קדימה מייצג וחלקות פיזור לוואי מהעכבר קנה נשימה לאחר משטח האפיתל ההפשטה. ii. חלקות FACS נציג לTROP2 ביטוי בתאי צינור קנה נשימה מעכבר.
2B איור.. cytometry זרימה של השעיות תא הבודדות ממשטח אפיתל הופשט משני השליש התחתון של עכבר קנה הנשימה מראה פיזור קדימה מייצג וחלקות פיזור לוואי. ii. עלילת FACS אופייני ITGA6 ביטוי בsurface האפיתל. ג. עוד עלילת FACS נציג של קדימה ופיזור מצד אפיתל פני שטח מראה האחורי gating של אוכלוסיית תאי הבסיס בירוק. ד. ITGA6 טיפוסי וTROP2 להביע אוכלוסיית תא בירוק.
איור 3. כמובן זמן פיתוח של תחומים. תחומי Duct א. Spheres צריך להיות גלוי בmatrigel לאחר כ 1 שבוע בתרבות וכמעט כולם צפופים במראה. תאים בודדים שאינו מהווים תחומים גם ראו. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). תחומים בסיסיים B. הם גדולים יותר וluminal בהופעה. תאים בודדים שאינו מהווים תחומים גם ראו. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר).
איור 4. הזרקה של תאי גזע לתוך צינור את תוצאות כרית שומן העכבר בהיווצרות של מבני submucosal בלוטה דמוית. מבנים מייצגיםמוצגים בכרית השומן וחלקם הראה הפקת mucin (כחול בהיר) עם שיף החומצה Alcian הכחול התקופתי הכתם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקה זו לבודד תאים הבזליים מצינור ודרכי הנשימה היא חשובה לשיפור ההבנה של דרך נשימת תיקון והתחדשות ומחלות של דרך נשימה שלנו. הטכניקות המתוארות כאן כוללות כמה שלבים קריטיים. הראשון הוא תקופת העיכול אנזימטי האופטימלית. השני הוא היצירה של השעית תא בודדה דרך סידורי passaging עם מחטי מד שעלה בהדרגה כדי למנוע הטית תא, אלא כדי לשבור את הגושים סלולריים. השלישי הוא ניתוח FACS, וgating של תאים עם נוגדנים מתאימים.
כחלק מאפיטופים משטח רצועת האנזימים, כמו ITGA6 וNGFR, שינוי אפשרי אחד הוא לשנות את פרוטוקולי עיכול האנזים לחוס על אפיטופים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לבודד תאי אנדותל קנה נשימה או תאי mesenchymal אחרים על ידי שינוי הנוגדנים הספציפיים למשטח סמנים על סוגי תאים.
המגבלות של הפרדת תאים הבזליים ודביקיםקשור לחוסר הנוכחי שלנו של סמן פני שטח כדי להבחין בין תאי צינור מתאי בסיס, ואת הצורך בהפשטת אפיתל פני שטח ואת האפשרות לעזוב כמה תאי בסיס, מאחור. זיהוי הסמנים פני עתיד במיוחד עבור תאי צינור יהיה להפוך את התהליך הזה לקל יותר וימנע את הצורך בהפשטת אפיתל פני שטח. זה יהיה גם לשלול את הצורך להשתמש בשני השליש התחתון של קנה הנשימה להכנות תאי בסיס טהורות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
ברצוננו להכיר את FACS הרחב תאי גזע מרכז המחקר ומודה במיוחד לג'סיקה סקולס ופליציה Codrea על עזר במיון תא. העבודה מומנה על ידי CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, אגודה אמריקנית בית חזה / COPD קרן ATS-06-065, קרן הדאגה, נבג Jonsson UCLA המקיף במרכז סרטן חזה אונקולוגיה תכנית / סרטן הריאות, הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה מחקר ועדת תיאום וGwynne הייזן דובדבן זכרון המעבדות (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 | |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 | |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI | |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 | |
Table 1. Complete media components. |
|||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea. |
|||
References
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
