Summary
Her viser vi vår protokoll for isolering av basal og submucosal kjertel duct celler fra mus tracheas. Vi også demonstrere metoden av å injisere stamceller i dorsal musen fett puten å skape en
Abstract
Den store luftveiene er direkte i kontakt med miljøet, og derfor utsatt for skader fra giftstoffer og smittestoffer som vi pusten i en. Den store luftveiene krever derfor en effektiv reparasjon mekanisme for å beskytte kroppen vår. Denne reparasjonsprosessen oppstår fra stamceller i luftveiene og isolere disse stamcellene fra luftveiene er viktig for å forstå mekanismene for reparasjon og regenerering. Det er også viktig for å forstå unormal reparasjon som kan føre til luftveissykdommer 2. Målet med denne metoden er å isolere en roman stamcelle befolkningen fra musen tracheal submukøst kjertel kanaler og å plassere disse cellene i in vitro-og in vivo modellsystemer for å identifisere mekanismene for reparasjon og regenerering av submukøst kjertler 3. Denne produksjonen viser metoder som kan brukes til å isolere og analysen kanalsystem og basal stamceller fra store luftveiene 3. Dette vil tillate osså studere sykdommer i luftveiene, slik som cystisk fibrose, astma og kronisk obstruktiv lungesykdom. Foreløpig er det ingen metoder for isolering av submukøst kjertel duct celler og det er ingen in vivo modeller for å studere regenerering av submukøst kjertler.
Protocol
Oversikt over Steps
1. Disseksjon av trachea
2. Rengjøring luftrøret og kutte det
3. Enzym fordøyelse og prosessering i enkel cellesuspensjon
4. Flekker for FACS og sortering
5. Behandler sortert celler for in vivo og in vitro modeller
1. Disseksjon av Trachea
- Avlive musen med en intraperitoneal injeksjon av 0,1 mg/0.2 cc pentobarbital.
- Skjær åpne bukveggen, og flytte tarmene til side for å avsløre abdominal aorta og deretter dissekere det.
- Åpne kisten ved å skjære gjennom membranen og fremre brystveggen på begge sider for å utsette hjertet og lungene. Fortsette å kutte opp i halsen fjerne fett og spyttkjertler å avsløre luftrøret.
- Fjern thymus og kutte lunge av sine forbindelser under og bak. Separspiste luftrøret fra spiserøret ved å sette en pinsett mellom dem deretter klippe luftrøret på sitt øvre meste over sin forbindelse med strupehodet. Deretter holder luftrøret med pinsett og dissekere den fra sitt feste og fortsetter nedover for å fjerne det med hjerte og lunge en-blokk. Skjær bort hjertet og lungene i nærheten av hilum å inkludere det meste av høyre og venstre viktigste bronkiene.
- Plasser luftrøret i en liten petriskål inneholdende samle mediet på is.
2. Rengjøring luftrøret og kutte det
- Under disseksjonsmikroskop, bruker veldig fin spiss tang (nr. 5) og Vännäs Tübingen saks (FST 15003-08 finescience.com) for å rengjøre luftrøret fra alle andre vev knyttet til den. Dette inkluderer: lymfeknuter, tilbakevendende laryngeal nerve, fett, skjoldbruskkjertel og gjenværende lunge fartøy. Den øvre delen av luftrøret trenger spesiell oppmerksomhet, for å fjerne de store laryngeal brusk uten at den største haug med SMGsom er inngitt mellom cricoid brusk og den første tracheal brusk ring (C1) 4.
- Skjær luftrøret inn i den øvre delen og den nedre delen mellom C4 & C5 og deretter kuttet åpen begge deler gjennom lumen av luftrøret.
3. Enzyme Fordøyelse og prosessering til Single Cell Suspension (SCS)
- Inkuber nedre del av luftrøret i 1 ml 16 U dispase i en Eppendorf-rør ved romtemperatur (RT) i 30 min, som tidligere beskrevet 5. Deretter tilsett 0,5 mg / ml DNase I i DMEM for en ytterligere 20 min ved RT.
- Fjern de fordøyd tracheas i frisk samle medium i en steril petriskål, og stripe overflaten epitel under disseksjonsmikroskop. Bruk en pipette for å overføre medium inneholdende strippet epitel til en 50 ml konisk rør.
- Spinne ned den strippede epitel ved 1000 xg ved 4 ° C. Fjern supernatanten, og legge 0,1% Trypsin / EDTA og inkuber mens risting the rør i en 37 ° C risteinkubator (200 rpm) i 30 min. Etter inkuberingen med en 1.000 pl spissen, pipetteres opp og ned for å bryte opp klumper og danne en enkelt cellesuspensjon.
- Plasser den øvre luftrør i en konisk rør inneholdende 1 ml 0,15% pronase. Deretter inkuber ved 4 ° C i 4 timer.
- Forsiktig vortex røret og deretter plassere luftrøret i frisk samle medium og bekreft under disseksjonsmikroskop at det er fullstendig avløsning av overflaten epitelet (SE).
- Finhakk luftrøret, med en skinnende saks for å åpne opp SMG avdelinger og deretter inkuberes i en time i pronase på RT med langsom risting.
- Spinne ned tracheal vev, fjerne pronase, legge 0,1% Trypsin / EDTA og inkuber ved 37 ° C i 30 min med risting som ovenfor.
- Passage fordøyd celler, klumper og eventuelle gjenværende biter av kjertler gjennom 20G, 23G og 26G nåler ved hjelp av en 10 ml sprøyte. Gjenta passaging flere ganger med hver p førstepping ned. Nå bør de fleste cellene være i en SCS.
- Filtrere suspensjonen gjennom en 40 uM sil deretter vaske silen og spinne ned cellene. Da Rekonstituer cellene i riktig volum av medium, telle celler og fortsette umiddelbart til FACS farging og sortering. Ikke la cellene i 4 ° C eller på is i flere timer fordi vi fant ut at dette påvirker levedyktighet og sterkt reduserer sfæren danner effektivitet.
4. Flekker for FACS og sortering
- Ta nok celler for fremstilling av de unstained og singel farget kompensasjon rør deretter flekken resten av cellene med primære antistoffer, geit Trop2 og rotte ITGA6, i 15 min ved RT. Vask deretter med PBS eller samle medium, remover supernatanten svært nøye og bryte cellepelleten.
- Flekken med passende sekundært antistoff, inkuberes i mørket ved RT i 10 minutter, vask og fjerne supernatanten og deretter bryte pelleten.
- På FACSARIA, etter justering din spenning og kompensasjon, gate ut rusk, veldig små celler, celle dubletter og døde celler. Deretter bør de fleste celler fra SE være TROP2 positive, mens 20-50% av SMG cellene vil være TROP2 + 6.
- Sett din sortering gate for Trop2 + ITGA6 + celler fra SE (basal celler) og for Trop2 + celler (+ /-ITGA6 positive celler) fra SMG (duct celler).
5. Behandler Sortert celler for: in vitro kultur og in vivo model
5.1 In vitro sfære forming 5-9 kultur
- Bland 100 ul "vekstfaktor reduserte Matrigel" med 100 ul av fullstendig medium 10,11 (se tabell 1) som inneholder opptil 50.000 sortert celler deretter sette denne blandingen i det øvre kammer av en 24-brønners trans-brønnen. Deretter settes 400 pl av komplett medium i nedre kammer og inkuber ved 37 ° C. Endre medium i nedre kammer annenhver dag og legge til ekstra 100fil Matrigelhver uke eller tidligere hvis det blir tynn.
5.2 In vivo-modell
- Rekonstituere sorteres cellepelleten i komplett medium blandet 1:1 med Matrigel ved en konsentrasjon på 5,000-10,000 celler per 50 ul.
- Anesthetize mottakernavnene C57/BL6 mus. Administrer Carprofen (5 mg / kg) subcutaenously som analgetikum. Sterilisere og barbere ryggen deretter foreta en sentral langsgående hud innsnitt i øvre del av ryggen. Innsnitt bør være stort nok til å identifisere fettpute injeksjonsstedet samt bleb som dannes etter injeksjon. Bruk den butte siden av saks å utvide poser mellom huden og baksiden av brystveggen på begge sider for å maksimere tilgang og visualisering.
- Identifisere den mediale grensen av scapula ved å skyve musa forbena opp og bakover for å se scapula flytting. Ta 50 ul av cellesuspensjonen i en 300 ul BD insulinsprøyte og injisere den i fettet puten bare mediale til skulderblad og lateralt forryggvirvlene. Du bør være i stand til å se en bleb ellers er du for dypt. Gjenta det samme på den andre siden så klipp eller sy huden innsnitt. Sjekk mus og gi Carprofen (5 mg / kg, SC) en gang daglig i 48 hr.
- Etter 3 uker, avlive mus med pentobarbatol (0,1 mg/0.2 cc, IP), åpne huden som ovenfor og dissekere hele fettpute fra begge sider med en sikkerhetsmargin for å unngå mangler noen vev struktur som kan ha dannet og utvidet rundt. Fikse i PFA og embed i parafin 12. Ekstrem forsiktighet bør utvises ved trimming og kutte blokken ikke å omgå eller overse en struktur. Den beste praksis er å trimme 40 mikrometer gang og deretter klippe en 4 mikrometer skive, legg den på et glass lysbilde og undersøke den under mikroskop for å bekrefte om det er noen "epiteliale strukturer" i denne delen av blokken eller ikke. Hvis det er noe sett, så trim og gjentar dette trinnet.
6. Representant Resultater
StriPPING av musen tracheas vil resultere i en denuded luftrøret som er synlig ved lysmikroskopi som vist i Figur 1A. Figur 1B viser den lysfelt visningen av en luftrøret etter epitelial stripping med submukøst kjertler blir utgitt fra vev og likner drueklaser.
Pronase fjerner ITGA6 epitop og dette er grunnen til at TROP2 kanalsystem celler ikke kan deles inn i ITGA6 + og - bestander. Imidlertid fordøyer dispase, som bevarer ITGA6 epitopen, alle overflaten epitel og kanalsystem celler selv med meget korte inkubasjonstider, og kan derfor ikke brukes for å skille kanalen fra basal celler 3. Flowcytometri av singelen cellesuspensjoner skulle vise frem scatter og side scatter plott som er representert i figur 2A. God separasjon av kanalsystem celler fra resten hvis de tracheal celler bør ses med det Trop2 antistoff i flowcytometri for fluorescerende aktivert celle sorting (FACS) som sett i figur 2B. Spheres bør være synlig i Matrigel etter ca 1 uke i kultur og er tette i utseende som vist i figur 3.. Effektiviteten av denne prosess er i størrelsesorden 1-2% og enkeltceller vil fortsatt være til stede i og Matrigel sannsynlig representerer celler fra de submukøst kjertel kanaler som ikke har evne til selv-fornyelse. Injeksjon av rørsystem stamceller i musen fettpute resulterer i dannelsen av submukøst kjertel-lignende strukturer som er vist figur 4. Disse er sett i blokkene selv uten H & E flekker. Dette er sfærisk og har en sentral lumen. Mange tverrsnitt må gjøres gjennom fettet pad for ikke å gå glipp av disse epiteliale strukturer.
Figur 1. Enzymatisk nedbrytning av tracheal epitel. Fjerning av overflate epitelceller vises med black piler, fjerning av celler i de submukøst kjertel kanaler vises med grønne piler. Utarmede tracheas som er synlig ved lysmikroskopi er vist etter 30 min dispase fordøyelse og etter 4 timers av pronase fordøyelsen.
Figur 2a. Jeg. Flowcytometri av encellete suspensjoner viser representative frem splitte og side spredningsplott fra mus tracheas etter overflaten epithelial stripping. ii. Representative FACS tomter for TROP2 uttrykk i kanalsystem celler fra mus tracheas.
Figur 2B. Jeg. Flowcytometri av encellete suspensjoner fra strippet overflaten epitel av de nedre to tredjedeler av musen trachea viser representant frem splitte og side scatter plott. ii. Typisk FACS tomt på ITGA6 uttrykk i surface epitel. iii. Annen representant FACS tomt på fremover og side scatter fra overflaten epitel viser tilbake gating av basal cell befolkningen i grønt. iv. Typisk ITGA6 og TROP2 uttrykke cellepopulasjon i grønt.
Figur 3. Tid løpet av utviklingen av kuler. A. Duct kuler. Spheres bør være synlig i Matrigel etter ca 1 uke i kultur og nesten alle er tett i utseende. Enkeltceller som ikke danner kuler er også sett. (Skala bar = 50 mm). B. Basal kuler er større og luminal i utseende. Enkeltceller som ikke danner kuler er også sett. (Skala bar = 50 mm).
Figur 4. Injeksjon av rørsystem stamceller i musen fettpute resulterer i dannelsen av submukøst kjertel-lignende strukturer. Representative strukturerer vist i fettpute og noen er vist å produsere mucin (lys blå) med Alcian blå Perjodsyre Schiff flekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknikken til å isolere duct og basal celler fra luftveiene er viktig for å forbedre vår forståelse av luftveiene reparasjon og regenerering og luftveissykdommer. Teknikkene som beskrives her inkluderer noen viktige skritt. Den første er den optimaliserte enzymatisk fordøyelse perioden. Den andre er etableringen av en enkelt celle suspensjon gjennom seriell passaging med stadig høyere gage nåler for å hindre celle shearing men å bryte opp celle klumper. Den tredje er FACS analyse, og gating av celler med egnede antistoffer.
Som noen av de enzymer stripe overflaten epitoper, som ITGA6 og NGFR, er en mulig modifikasjon å endre enzymet fordøyelsen protokoller til overs epitopene. Denne protokollen kan også brukes til å isolere tracheal endotelceller eller andre mesenchymale celler ved å endre de spesifikke antistoffer til overflaten markører på celletyper.
Begrensningene av separasjon av kanalsystem og basal cellerer relatert til vår nåværende mangel av en overflate markør for å skille kanalsystem celler fra basal celler og behovet for overflate epitelial stripping og muligheten for å forlate noen basale celler bak. Fremtidig identifisering av overflate markører spesielt for duct celler vil gjøre denne prosessen enklere og fjerne behovet for overflate epithelial stripping. Det vil også oppheve behovet for å bruke de nedre to tredjedeler av trachea for rene basalcelle preparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å erkjenne den brede Stem Cell Research Center FACS og spesielt takke Jessica Scholes og Felicia Codrea for deres hjelp med celle sortering. Arbeidet ble finansiert av CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / KOLS Foundation ATS-06-065, The Concern Foundation, The UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / Lung Cancer SPORE, University of California Cancer Forskning Coordinating Committee og Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 | |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 | |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI | |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 | |
Table 1. Complete media components. |
|||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea. |
|||
References
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
