Summary
Här visar vi vår protokoll för isolering av basala och submukosal celler körtel kanal från mus trakea. Vi visar också metoden för att injicera stamceller i den dorsala musen fett pad för att skapa en
Abstract
Den stora luftvägarna är i direkt kontakt med omgivningen och därför känslig för skador från gifter och smittämnen som vi andas in 1. Den stora luftvägarna kräver därför en effektiv reparation mekanism för att skydda våra kroppar. Denna reparationen sker från stamceller i luftvägarna och isolera dessa stamceller från luftvägarna är viktig för att förstå mekanismerna för reparation och förnyelse. Det är också viktigt för att förstå onormal reparation som kan leda till luftvägssjukdomar 2. Målet med denna metod är att isolera en ny population stamceller från mus trakeala submukosala körtel kanaler och placera dessa celler in vitro och in vivo modellsystem för att identifiera mekanismer reparation och regenerering av submukosala körtlar 3. Denna produktion visar metoder som kan användas för att isolera och analysera de kanal-och basala stamceller från stora luftvägarna 3. Detta kommer att ge ossatt studera sjukdomar i luftvägarna, såsom cystisk fibros, astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom. För närvarande finns det inga metoder för isolering av submukosala gland duct celler och det finns inga in vivo-modeller för att studera regenerering av submukosala körtlar.
Protocol
Disposition av steg
1. Dissektion av trakea
2. Rengöring luftstrupen och skär den
3. Enzymnedbrytning och bearbetning till enkelcellsuspension
4. Färgning för FACS och sortering
5. Bearbetning sorterade celler för in vivo och in vitro-modeller
1. Dissektion av Luftstrupe
- Euthanize musen med en intraperitoneal injektion av 0,1 mg/0.2 ml av pentobarbital.
- Skär upp bukväggen och flytta tarmarna åt sidan för att exponera bukaorta och dissekera den.
- Öppna bröstet genom att skära igenom membranet och främre bröstkorgen på båda sidor för att exponera hjärtat och lungorna. Fortsätt att klippa upp i halsen att ta bort fett och spottkörtlar att exponera luftstrupen.
- Ta bort bräss och skär lungan av dess anslutningar nedan och bakom. Separåt luftstrupen från matstrupen genom att sätta en tång mellan dem skära då luftstrupen vid sin övre största delen över dess samband med struphuvudet. Håll sedan luftstrupen med pincett och dissekera det från dess fastsättning och fortsätta nedåt för att ta bort det med hjärta och lungor sv-blocket. Skär bort hjärta och lungor nära hilum att omfatta större delen av höger och vänster huvudbronker.
- Placera luftstrupen i en liten petriskål innehållande samla mediet på is.
2. Rengöring luftstrupen och skär den
- Enligt dissekera mikroskop, använder mycket fin spets pincett (nr 5) och Vännäs Tübingen saxar (FST 15.003-08 finescience.com) för att rengöra luftstrupen från alla andra vävnader fäst vid den. Detta omfattar: lymfkörtlar, återkommande laryngeal nerv, fett, sköldkörteln och resterande pulmonella fartyg. Den övre delen av luftstrupen kräver särskild uppmärksamhet, för att ta bort de stora laryngeala brosk utan att äventyra största gäng SMGsom lämnas mellan krikoidbrosket och den första trakeala brosk ring (C1) 4.
- Skär luftstrupen i den övre delen och den undre delen mellan C4 & C5 och sedan skära upp båda delarna genom lumen av luftstrupen.
3. Enzymnedbrytning och bearbetning till enkelcellsuspension (SCS)
- Inkubera den nedre delen av luftstrupen i 1 ml 16 U dispas i ett Eppendorf-rör vid rumstemperatur (RT) under 30 minuter, såsom beskrivits tidigare 5. Tillsätt sedan 0,5 mg / ml DNas I i DMEM under ytterligare 20 min vid RT.
- Ta bort de nedbrutna trakea i färskt samla medium i en steril petriskål och skala av ytan epitel under dissekera mikroskop. Använd en pipett för att överföra mediet innehållande avskalade epitelet till en 50 ml koniskt rör.
- Spinn ner den avskalade epitelet vid 1.000 xg vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och tillsätt 0,1% trypsin / EDTA och inkubera under skakning the röret i en 37 ° C inkubator skakning (200 rpm) under 30 minuter. Efter inkubationen med en 1.000 il spets, pipettera upp och ned för att bryta upp klumpar och bildar en enda cellsuspension.
- Placera den övre trakea i ett koniskt rör innehållande 1 ml av 0,15% pronas. Därefter inkubera vid 4 ° C under 4 timmar.
- Vortexa försiktigt röret och sedan placera luftstrupen i färskt insamling medium och bekräfta under dissekera mikroskop att det är komplett avskildhet av ytan epitel (SE).
- Finhacka luftstrupen med en fin sax för att öppna upp SMG facken och sedan inkubera en timme i pronas vid RT med långsam skakning.
- Centrifugera ner den trakeala vävnaden, bort pronas, tillsätt 0,1% trypsin / EDTA och inkubera vid 37 ° C under 30 min med skakning såsom ovan.
- Passage de spjälkade cellerna, klumpar och eventuella återstående bitar av körtlar genom 20G, 23G och 26G nålar med en 10 ml spruta. Upprepa passage flera gånger med varje nål storlek innanavgå. Nu bör de flesta celler vara i ett SCS.
- Filtrera suspensionen genom en 40 M sil sedan tvätta silen och spinn ner cellerna. Då beredning av cellerna i lämplig volym av medium, räkna cellerna och gå direkt till FACS färgning och sortering. Lämna inte celler i 4 ° C eller på is i flera timmar eftersom vi fann att detta påverkar lönsamheten och allvarligt minskar sfären bildar effektiviteten.
4. Färgning för FACS och Sortering
- Ta tillräckligt med celler för att förbereda de ofärgade och enda färgade ersättning rör sedan färga resten av cellerna med primära antikroppar, Trop2 get och råtta ITGA6, under 15 min vid rumstemperatur. Tvätta sedan med PBS eller samla medium, remover supernatanten noga och bryta cellpelleten.
- Stain med lämplig sekundär antikropp, inkubera i mörker vid rumstemperatur under 10 min, tvätta och avlägsna supernatanten och sedan bryta pelleten.
- På FACSARIA, efter justering din spänning och ersättning, grind ut skräpet, mycket små celler, dubbletter cell och döda celler. Då bör de flesta celler från SE vara TROP2 positiv medan 20-50% av SMG celler blir TROP2 + 6.
- Ställ in sortering grind för Trop2 + ITGA6 + celler från SE (basalceller) och för Trop2 + celler (+ /-ITGA6 positiva celler) från SMG (kanal celler).
5. Behandling sorterade cellerna för: in vitro-kultur och in vivo-modell
5,1 In vitro sfär bildar 5-9 kultur
- Blanda 100 pl "tillväxtfaktor reducerad Matrigel" med 100 pl komplett medium 10,11 (se tabell 1) innehållande upp till 50.000 sorterade celler sedan sätta denna blandning i den övre kammaren i en 24-brunnars trans-brunn. Sedan sätts 400 | il fullständigt medium i nedre kammaren och inkubera vid 37 ° C. Förändring medium i nedre kammaren varannan dag och lägga till extra 100 pl Matrigelvarje vecka eller tidigare om det blir tunt.
5,2 in vivo-modell
- Rekonstituera sorterade cellpelleten i komplett medium blandades 1:1 med Matrigel vid en koncentration av 5,000-10,000 celler per 50 pl.
- Söva mottagarländernas C57/BL6 möss. Administrera Karprofen (5 mg / kg) subcutaenously som ett analgetikum. Sterilisera och raka ryggen gör sedan en central längsgående snitt i huden på övre delen av ryggen. Snittet bör vara tillräckligt stor för att identifiera platsen fett pad injektion samt bubblan som bildas efter injektion. Använd den trubbiga sidan av sax för att bredda påsar mellan huden och baksidan av bröstkorgen på båda sidor för att maximera tillgänglighet och visualisering.
- Identifiera den mediala kanten av skulderbladet genom att trycka på musen forelimb upp och bakåt för att se skulderbladet rör sig. Ta 50 | il av cellsuspensionen i en 300 pl BD insulinspruta och injicera den i fettkudden bara medialt till skulderbladet och lateraltkotorna. Du bör kunna se en blåsa annars är du för djupt. Upprepa samma sak på den andra sidan och sedan klämma eller sy i huden snitt. Kontrollera möss och ge Karprofen (5 mg / kg, SC) en gång dagligen under 48 timmar.
- Efter 3 veckor, avliva möss med pentobarbatol (0,1 mg/0.2 cc, IP), öppna huden enligt ovan och dissekera hela fettkudden från båda sidor med en säkerhetsmarginal för att undvika att missa någon vävnadsstruktur som kan ha bildats och utvidgas runt. Fix i PFA och bädda i paraffin 12. Extrem försiktighet bör användas vid trimning och skärning blocket inte att kringgå eller bortse från en struktur. Det bästa är att trimma 40 um gång sedan skära en 4 um skiva, placera den på en glasskiva och undersöka den i mikroskop för att bekräfta om det finns några "epiteliala strukturer" i denna del av blocket eller ej. Om det inte finns något sett så trimma en gång till och upprepa detta steg.
6. Representativa resultat
Stripping av mus trakea kommer att resultera i en blottad luftstrupen som är synligt genom Ijusmikroskopi, såsom visas i figur 1A. Figur 1B visar brightfield vy av en trakea efter epitelialt strippning med submukosala körtlar släpps från vävnaderna och liknar klasar av druvor.
Pronase bort ITGA6 epitopen och det är därför de TROP2 kanal cellerna inte kan delas upp i ITGA6 + och - populationer. Emellertid smälter dispas, som bevarar ITGA6 epitopen, all ytepitelet och kanalen cellerna även med mycket korta inkubationstider, och kan därför inte användas för att separera kanal från basalceller 3. Flödescytometri av enkelcellsuspensioner bör visa framåt scatter och sido spridningsdiagram som är representerade i figur 2A. God separation av kanal celler från resten om de trakeala celler bör ses med Trop2 antikroppen i flödescytometri för fluorescerande aktiverad cell sorting (FACS) såsom visas i fig 2B. Sfärer bör vara synlig i Matrigel efter ca 1 vecka i kultur och är tät i utseende som visas i figur 3. Effektiviteten i denna process är i storleksordningen 1-2% och enstaka celler kommer fortfarande finnas i Matrigel och sannolikt representerar celler från submukosala körtel kanaler som inte har förmåga till självförnyelse. Injektion av kanal stamceller i musen fettkudden resulterar i bildning av submukosala körtel-liknande strukturer som visas Figur 4. Dessa ses i blocken även utan H & E-färgning. Dessa är sfäriska och har en central lumen. Många tvärsnitt måste göras genom fettkudden för att inte missa dessa epiteliala strukturer.
Figur 1. Enzymatisk digerering av trakeal epitel. Avverkning av grova epitelceller visas med BLACk pilar, avlägsnande av celler i submukosala körtel kanaler visas med gröna pilar. Blottlagda trakea som är synliga genom Ijusmikroskopi visas efter 30 min av dispas matsmältning och efter 4 timmar av pronas matsmältning.
Figur 2A. I.. Flödescytometri av enkelcellsuspensioner visar representativa framåt scatter och side tomter scatter från mus trakea efter ytan epitel strippning. ii. Representativa FACS tomter för TROP2 uttryckning i kanalsystem celler från mus trakea.
Figur 2B. I.. Flödescytometri av enkelcellsuspensioner från avskalade ytepitelet av de lägre två tredjedelar av mus luftstrupen visar representativa framåt scatter och side tomter scatter. ii. Typiska FACS tomt på ITGA6 uttryck i SUrface epitel. iii. En annan representativ FACS tomt framåt och sidospridning från ytan epitel visar upp slussning av basala cellpopulationen i grönt. iv. Typisk ITGA6 och TROP2 uttrycker cellpopulationen i grönt.
Figur 3. Tidsförlopp för utveckling av sfärer. A. Duct sfärer. Sfärer bör vara synlig i Matrigel efter ca 1 vecka i kultur och nästan alla är täta utseende. Enstaka celler som inte bildar sfärer ses också. (Skala bar = 50 nm). B. Basala sfärer är större och luminala utseende. Enstaka celler som inte bildar sfärer ses också. (Skala bar = 50 nm).
Figur 4. Injektion av kanal stamceller i musen fettkudden resulterar i bildning av submukosala körtel-liknande strukturer. Representativa strukturervisas i fettkudden och några visas producerar mucin (ljusblå) med Alcian blue perjodsyra Schiff fläck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna teknik för att isolera kanal och basala celler från luftvägarna är viktig för att förbättra vår förståelse av luftvägarna reparation och förnyelse och lungsjukdom. De metoder som beskrivs här med några viktiga steg. Den första är den optimerade enzymatisk digerering perioden. Den andra är att skapa en enda cell suspension genom seriepassage med successivt högre gage nålar för att förhindra cell klippning utan att bryta upp cellklumpar. Den tredje är den FACS-analys, och gating av celler med lämpliga antikroppar.
Som några av de enzymer epitoper bandytan, såsom ITGA6 och NGFR, är en möjlig modifiering att ändra protokoll enzymdigestion att skona epitoperna. Detta protokoll kan också användas för att isolera trakeala endotelceller eller andra mesenkymala celler genom att förändra de specifika antikropparna att ytmarkörer på celltyper.
Begränsningarna av separation mellan kanal och basala cellerär relaterade till vår nuvarande bristen på en yta markör för att skilja kanal celler från basalceller och behovet av ytan epitelial strippning och möjligheten att lämna några basalceller bakom. Framtida identifiering av ytmarkörer speciellt för kanal celler kommer att göra denna process enklare och undanröja behovet av ytan epitelial strippning. Det kommer också att förneka behovet av att använda de lägre två tredjedelar av luftstrupen för rena basal cellpreparat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill erkänna de allmänna Stem Cell FACS Research Center och särskilt tacka Jessica Scholes och Felicia Codrea för deras hjälp med cellsortering. Arbetet har finansierats av CIRM RN2-00.904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / KOL Foundation ATS-06-065, den oro Foundation, UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / lungcancer SPOR, University of California Cancer Forskning samordningskommitté och Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 | |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 | |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI | |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 | |
Table 1. Complete media components. |
|||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea. |
|||
References
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
