기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

Summary

우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

Abstract

면역 CD4 ⁺ 규제 T 세포 (Tregs)의 개발과 유지 보수 및 인체에 대한 자신과 공생 항원의 광대한 양의 immunologic의 항상성 유지에 필요한 말초 관용에 기여한다. Tregs 및 염증성 종래의 T 세포 사이의 균형을 Perturbations는 immunopathology이나 암이 발생할 수 있습니다. Tregs의 치료 주사는 대장염 ^1, 유형 I 당뇨병 ^2, 류마티스 관절염 및 이식편 대 숙주 질환, 인간 대 마우스 Treg 생물학 ^{5 4} 몇 가지 근본적인 차이점 murine 모델에 효과있는 것으로 표시되었지만 지금까지 임상 사용을 배제하고있다. 충분한 숫자, 순도, 안정성 및 치료 Tregs의 유도 특이성의 부족들이 전직 생체내 확장 ⁶ 조건을 최적화할 수있는 인간 Treg 개발의 역동적인 플랫폼을 necessitated.

여기 D4 단계로 세분 수있는 단일 인간의 말초 혈액 기증자로부터 유도된 Tregs (iTregs)의 차별 화를위한 방법 방접원을 그리다 : 말초 혈액 mononuclear 세포, CD4의 자기 선택 ⁺ T 세포의 절연, 체외 세포 배양 및 형광의 활성화 T 세포 하위 집합의 셀 정렬 (FACS). Treg 서명 전사 인자의 forkhead 상자 P3 (FoxP3)는 인간 ^7의 활성화 유발 전사 인자이며 다른 독특한 마커 존재 마커 조합 패널 억제 활동과 T 세포를 식별하는 데 사용해야하기 때문에. 문화에 6 일이나하면 Google 시스템에서 세포 나이브 T 세포, CD25 및 CD45RA들의 상대적인 표현을 기반으로 메모리 T 세포 또는 iTregs로 demarcated 수 있습니다. 메모리와 나이브 T 세포가 다른보고 편광 요구 사항 및 plasticities ^8을 가지고로서 CD45RA ^+와 CD45RO로 초기 T 세포 인구의 사전 분류 ⁺ 하위 집합 수 B전자는 이러한 불일치를 검사하기 위해 사용됩니다. 다른 사람과 일치하는, 우리의 CD25 ^안녕 CD45RA ^- FoxP3 ⁹ iTregs 명시적 높은 수준의, GITR 및 CTLA-4 ¹¹ CD127 ¹² 낮은 수준. 각 인구의 FACS 따라 결과 세포 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE) - 라벨 T 세포 autologous의 확산을 병신하는 상대적 능력을 평가하고 억압 분석에 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 버피 코트에서 사람 말초혈 Mononuclear 전지 (PBMCs)의 분리

1. 병원이나 인근의 혈액 센터 위치에서 버피 코트 하나의 단위를 취득. 우리의 혈액 센터는 정상적인 혈액 기증자로부터 얻은 단위당 버피 코트 40-60 대한 ML 우리에게 제공합니다.
2. 버피 코트를 희석하기 위해 멸균 PBS를 포함하는 autoclaved 500 ML 유리 병으로 혈액을 붓고. PBS + 버피 코트의 최종 부피 250 ML이어야합니다.
3. 20 ML의 Lymphoprep 솔루션으로 각 열 50 ML 원뿔 튜브를 입력합니다.
4. 부드럽게 Lymphoprep 솔루션을 방해하지 않도록주의되는 희석 버피 코트의 25 ML과 Lymphoprep 솔루션을 입혀라.
5. 500 X g에서 실온에서 30 분간 튜브를 봐. 림프구 분율을 방해하지 않는만큼, 원심의 브레이크를 해제해야합니다.
6. 피펫으로 Lymphoprep 및 플라즈마 - 중간 계층 간의 인터페이스에서 PBMCs를 수집합니다. 약 1 ML까지 플라즈마 - 중간 오프를 기음아직 PBMCs을 포함 버피 코트 레이어를 다룹니다. 새로운 50 ML 관에 PBMCs를 전송하는 10 ML의 피펫을 사용합니다.
7. PBS로 두 번 세포를 씻어 후 hemocytometer 의지에 대한 차가운 RPMI의 50 ML에 세포를 resuspend. 1 X 10 ⁹ PBMCs - 일반적인 복구는 8 × 10 ^8이다.

이 절차는 혈액의 작은 볼륨 크기를 줄일 수 있습니다. 전체 혈액 샘플의 희석은 PBS에 1시 1분입니다.

2. 총 CD4의 자기 부정적 선택 ⁺ T 세포, CD4 ⁺ CD45RA ⁺ 나이브 T의 셀 또는 CD4 ⁺ CD45RO ⁺ EasySep 농축 키트를 사용하여 PBMCs에서 메모리 T 세포 (줄기 세포 기술)

4.25 X 10 ⁸ PBMCs ~ 1 × 10 ^8시 따라야 할 단계.

1. 2퍼센트 FBS 및 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 PBS에서 ML 당 5 × 10 ^7의 최종 농도로 Resuspend의 PBMCs. 신선한 14 ML의 폴리 프로필렌 원형 바닥 튜브에 세포를 이동합니다.
   총 인간의 CD4 ⁺ T 세포가 부정적인 선택에 의한의 분리 : 인간의 CD4 ⁺ T 세포 농축 항체의 칵테일 (PBMCs의 ML 당 50 μL), 믹스와 실온에서 10 분간 부화를 추가합니다.
   1. 부정적인 선택에 의해 인간 나이브 T 세포의 격리가 : PBMC의 세포 현탁액, 믹스 ML 당 방지 CD45RO 항체의 50 μL를 추가하고 실온에서 15 분 동안 품어. 10 분간 상온에서 키트 (PBMCs의 당 ML 50 μL), 믹스와 부화와 함께 제공되는 농축 칵테일을 추가합니다.
   2. 부정적인 선택에 의해 인간의 기억 T 세포의 격리는 : 인간 메모리 CD4 ⁺ 항체의 T 세포 농축 칵테일 (PBMCs의 ML 당 50 μL), 믹스를 추가하고 실온에서 10 분 동안 품어.
2. 동등 솔루션 전반에 걸쳐 그들을 배포할 잘 자성 입자를 섞는다. 나이브 키트에서 와동하지 nanoparticles 해.
3. 자성 입자를 (100 총 CD4위한 PBMCs의 ML 당 μL ^+와 나이브 T 세포 선택, 메모리 T 세포 선정 PBMCs의 ML 당 50 μL) 추가합니다. 부드럽게 나이브 T 세포 선택을위한 10 분 또는 메모리 또는 총 CD4 ⁺ T 세포의 선택 5 분 동안 상온에서 3 배 및 부화를 pipetting하여 섞는다.
4. PBS가 튜브 당 10 ML에 볼륨을 가져 2퍼센트 FBS와 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 추가합니다. 부드럽게 총 CD4 ⁺ T 세포, 순진 및 메모리 하위 집합 각각에 대해 5, 10 또는 2.5 분 실버 EasySep 자석으로 uncapped 튜브를 삽입하기 전에 3 배를 pipetting하여 섞는다.
5. 여전히 EasySep 자석의 튜브를 통해 관심있는 세포를 분리하기 위해 새로운 50 ML 튜브에 액체를 부어.
6. 단계 2.5 나은 복구를 위해 2.6을 반복합니다.

3. 세포 배양 조건 규제 T 세포를 유도해야

1. 에 의한 1 단계와 2 단계, 코트 조직 배양 플레이트 전날 먼저 (안티 인 경우에는 3 번 CD 항체를 diluting멸균 PBS 1 μg / ML의 농도에 OKT3 클론). 6 잘 접시는 PBS의 2 ML + 잘마다 안티 인 경우에는 3 번 CD를 추가할 경우, 12도 접시 1 ML을 추가 또는 24도 접시 당 500 μL 잘 추가하십시오. 코팅 번호판 4시 ° C에서 사용할 때까지 유지.
2. RPMI-1640 2.06 밀리 권총을 미리 보충 Glutamax - 전 25 MM 10 % 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신 및 50 μm의 β-메르 캅 토 에탄올을 추가하여 편광 매체를 준비합니다 HEPES 버퍼. 다음, 2 NG / ML TGF-β와 5 NG / ML IL-2를 추가합니다. 여기, 한 리간드 또는 미디어에 관심 억제제를 추가할 수 있습니다. 2 X 10 ⁶ 세포 / 편광 매체 ML의 농도에서 2 단계의 세포를 Resuspend.
3. 37 미리 따뜻한 접시 ° C와 세포를 추가하기 전에 안티 인 경우에는 3 번 CD-코팅 우물의 PBS를 기음. 6 잘 접시, 24 잘 접시 12 잘 접시 또는 세포의 1 ML에 대한 세포의 2 ML에 대해 4 ML 당 우물의 세포 현탁액을 추가합니다. 의 증발을 줄이기 위해 PBS와 빈 우물을 채워미디어. 37 ° C / 5% CO _2에서 3 일 동안 알을 품다.
4. 3 일 게시물 도금에서, 500 X g에서 5 분간 원심에서 접시를 돌리다. 접시의 바닥에 T 세포를 방해하지 않고, 미디어의 절반을 제거하고 새로운 미디어로 바꿉니다. 우물이 세포 (3 × 10 ⁶ / ML 이상의 농도)로 초만원 된 경우 또는, 동등하게 다른 반 인 경우에는 3 번 CD 코팅 강판으로 볼륨을 분리하고 원래의 볼륨으로 다시 새로운 매체를 추가하십시오. 37 ° C / 5% CO _2에 두명 게 세 일 동안 알을 품다.

4. T 세포의 세 인구의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS)

1. 멸균 PBS에 0.​​5 % (W / V) 소 혈청 알부민 (BSA)과 2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하여 버퍼를 세척 FACS를 준비합니다. 4에 플레이스 버퍼 ° C 감기 얻으려고 말야.
2. 잘 세포 배양에서 세포를 제거하고 전체 세포 회복을 위해 PBS의 2 ML 각 우물을 린스. 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브에있는 모든 세포를 놓고 10 500 XG에 원심 분리기분 4에 ° C.
3. 세포 밀도를 결정하는 hemocytometer에 세포를 세어보세요.
4. 장소 3-5 보상 컨트롤에 대한 각자 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 튜브 회 × 10 ⁵ 세포. 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브, 튜브 당 더 이상 35 이상 X 10 ⁶ 세포에 남아있는 세포를 놓습니다.
5. 4 ° C와 대기음 미디어에서 5 분 동안 세포를 내려 봐. 1 X 10 ⁶ 세포마다 추위 세척 버퍼의 90 μL으로 정렬되는 세포를 Resuspend. 감기 세척 버퍼 보상 제어 튜브의 100 μL에 Resuspend.
6. 정렬되는 셀, 안티 CD25-PE 2 μL, 안티 CD45RA-PE-Cy5 3 μL 및 1 회 안티 CD127-APC의 1 μL X 10 ⁶ 세포를 결합. 네 번째 튜브에 방지 CD127-APC의 세 번째 튜브 and1 μL로 PE-Cy5 ^- 최초의 보상 제어 튜브, 두 번째 튜브에 안티 CD25-PE 2 μL, 안티 CD45RA 3 μL에 아무런 항체를 추가 없습니다. 어둠 속에서 45 분 동안 얼음에있는 모든 튜브를 품어.
7. 버퍼를 세척의 ML 당 1 X 10 ⁷ 세포의 농도에서 버퍼와 resuspend 세포를 기음. 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 필터링하기 전에 세포의 ML 당 DNase II 1.5 μL를 추가합니다. 관 당 더 이상 3.5 이상 ML 여러 다섯 ML의 원형 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 세포를 이동합니다. 버퍼를 닦고 300 μL로 보상 제어 세포를 Resuspend.
8. PE, APC와 PE-Cy5 필터에 의해 교차 검출을 최소화하기 위해 MoFlo 흐름 cytometer에 대한 보상을 설정합니다. 한 ML 갓 태어난 송아지의 혈청을 포함하는 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 T 세포, 순진 (CD25-CD45RA ^+)와 메모리 (CD25 ^{- -} CD45RA) ^- iTregs을 (세포가 CD25 ^하이 CD127 ^-/LOW CD45RA) 정렬 게이트를 설정합니다.

5. 억제 분석

1. suppr 만들기ession 분석의 100 U / 페니실린의 ML, 스트렙토 마이신 100 μg / ML, 5 NG / ML IL-2 및 TGF-β에 AIM-V의 2 NG / ML를 추가하여 미디어.
2. 분석의 날, heterologous CD4 ^+와 같은 1 단계와 2 단계에 표시된 버피 코트에서 T 세포를 정화. 이것은 억압 분석의 대상 세포되며 그림 2 주 0에서 볼 수 있듯이, CD25 ⁺ Treg 세포를 포함하지 않습니다.
3. 세포 대신에 2 μL의 ML 당 5 밀리미터 주식 솔루션의 1 μL를 사용을 제외한 제조 업체의 지침에 따라 같은 CellTrace 키트와 라벨 세포. 직접 빛으로부터 밖으로 유지할 수있다는 것은, 5 밀리미터 주식 솔루션을 만들기 위해 CFSE 중 하나를 유리병에 CellTrace 키트가 제공 DMSO 18 μL를 추가합니다. 1 X 10 ⁶ 세포 / ML의 최종 농도로 prewarmed PBS + 0.1 % (W / V) BSA의 대상 세포의 필수 수를 (1 × 10 ⁷ 최대) Resuspend. 세포의 ML 당 5 밀리미터 CFSE 1 μL를 추가 및 5 minut 위해 37 ° C의 물을 욕조에 품어네;. 염색법을 끄다 5 분 동안 얼음에 품어 10 % FBS와 완전 얼음 차가운 RPMI 5 볼륨을 추가합니다. 추위 전체 RPMI 및 resuspend 1 회 이상 전지 × 10 억제 분석 매체의 100 μL 당 ⁵ 세포. 씻으십시오
4. Treg 억제 감독관 구슬은 2 X 10 ⁷ 구슬 / ML의 주식 농도에 있습니다. 구슬의 펠렛 숫자 eppendorf 튜브에 빨리 원심 분리하여 실험 당 세포의 총 수를 같음. RPMI하고 다시 펠렛과 함께 한 구슬을 씻는다. RPMI의 흡인 후 resuspend 비즈 일이 잘되어 당 구슬의 해당 금액은 억제 분석 매체의 8 μL에 있다고.
5. 96 잘 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에, 원하는 대상에 CFSE 묻은 세포 (1 × 10 ⁵ 세포 / ML), 경위 비즈와 신선한 억제 분석 미디어의 편광과 정렬된 세포 (1 × 10 ⁵ 세포 / ML)을 추가 (CFSE의 스테인드) : 200 μL의 최종 볼륨에서 효과기 (정렬)의 비율. 모든 조건은 tripli에서 설정합니다cates.
6. 물론 당 92 μL 억제 검정 매체에 CFSE의 스테인드 세포 100 μL, 경위 비즈 8 μL 신선한, 흠없는 세포 1 × 10 ^5를 추가하여 두 제어 조건의 첫 번째를 준비합니다. 위와 같은 세포 구성 요소지만, 감독관 비즈를 Treg 않고 두 번째 컨트롤을 준비합니다.
7. 5 일 동안 37 ° C / 5% CO _2로 알루미늄 호일과 부화에 커버 플레이트.
8. 어둠에서 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 pipetting과 장소에 의해 각각의 우물에서 세포를 수집합니다. 4 ° C, 기음 미디어에서 5 분 500 XG에 세포를 원심 분리기, 그리고 4 단계에서 버퍼를 닦고 300 μL 추운 FACS에 resuspend. 처음 3 X 10 ⁴ CFSE ⁺ 세포 퀘스트 소프트웨어와 히스토그램에서 대상 세포를 대표하는 라이브 림프구 게이트에서 이벤트를 분석.

6. 대표 결과

흐름 cytometric pseudocolor의 예 5 일간의 시간을 기 이상의 플롯을 점rse 모니터링 iTreg 차별이 FoxP3과 CD25의 공동 표현 상대를 기반으로, CTLA-4 및 CD45RA는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 그림 3의 히스토그램은 iTregs (CD25 ^하이 CD45RA ^- CD127 ^{-/LOW 세포)가} 정렬되는 성공적인 억압 분석 보여줍니다. 규제 / 억제 능력을 인수했다고 5 일 문화의 유일한 부분 집합이다를 그림 4는 Tregs의 유도를 보여줍니다 나이브 T 세포 풀 (상단 패널) 및 표준 iTreg 매체에서 5 일간의 문화 이후에 메모리 T 세포 풀 (하단 패널)에서. 초기의 세포 CFSE의 염색법 역시 순진 (오른쪽 위 패널) 또는 메모리 T 세포 (하단 오른쪽 패널) 만 세포 분열 몇 라운드 후 iTregs (최고 FoxP3 - 표현 세포)로 구분 것을 보여줍니다.

그림 1. 실험 절차의 도식. PBMCs ART 세포 ^{- +} CD25 CD4의 자기 부정적인 선택을하기 전에 기울기 원심 분리를 통해 인간의 말초 혈액 중에 분리 5. 문화 5-6일 후, 세포는 FACS를 받아야하고 진압하는 활동을 측정하는 heterologous CFSE 분류 대상 세포와 공동 incubated됩니다.

그림 2 죄를 씻고 인간의 기본 CD4 ⁺ CD25 ^-. T 세포가 매체를 iTreg에서 배양해 있습니다. 세포가 나누어지는가 CD45RA, FoxP3, CTLA-4와 CD25 마커의 진행 상황을 모니터링하는 단지 격리 (매일 0) 이후 및 일 1, 3 및 세포 배양 5에서 수집됩니다. iTreg 프로필 CD45RA에 해당 ^- FoxP3 ^{안녕하세요,} CTLA-4와 CD25 ^{안녕 안녕하세요} (인 - 그래프 창에 강조).

그림 3. ⁺ CFSE 라 CD4 투석을beled 세포 (1 × 10 ⁵ / 잘가) 정렬 순진, 메모리 또는 iTreg 세포의 면전에서 억제 경감 구슬을 Treg 함께 배양해있다 (3 × 10 ⁴ /도).에게 5 일 후에 세포가 수확되고 스테인드 세포 CFSE 프로필이 유동세포계측법에 의해 분석됩니다. iTreg 세포의 존재는 완전히 CD4의 확산 ⁺ T 세포를 abolishes. 숫자 본부받은 CFSE-라벨이 세포의 비율을 나타내는입니다.

그림 4 인간의 기본 순진 죄를 씻고. (CD4 ⁺ CD25가을 ^- CD45RA ^+)와 메모리 (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ T 세포가 CFSE와 매체 iTreg의 교양 물들일 수 있습니다. 5 일 후에 세포 phenotyped과 세포 분열 속도가 예상됩니다. 다른 이름으로 그림 2에 표시된 두 집합에서 차별 iTreg 집합은 해당CD45RA ^- CD25 ^안녕 FoxP3 ^하이와 CTLA-4 ^{안녕하세요} (후자이 보이지 않음). 비교 CFSE의 염색법 프로필은 5 일 문화 중 가장 proliferative 세포로 iTregs를 (여기서는 가장 높은 표현 FoxP3 T 세포 등)를 확인하실 수 있습니다.

Discussion

Treg 전송, 그들의 효율적인 생성 및 안정적인 유지 보수 방법을 autoimmunity 그래프트 거절 및 다른 면역 또는 염증 - 매개 질환을 퇴치에 엄청난 치료 가능성을 가지고 있지만 아직 개발되지 않았습니다. 인간의 T 세포를 순환만이 1-5%는 Tregs가로서 자신의 제어 확장과 차별화는 병원에 Tregs의 구현의 주요 억지력으로 소수를 극복. 우리가 TGN1412 재판 ^{13 일부터} 배운대로 반면에, 그것은 심히 분자 이벤트를 이해하기 위해 과학적으로 그리고 윤리적으로 필요한 모든 치료 처방을 구현하기 전에 조정 인간 T 세포의 운명 결정니다. 차별 iTreg이 방법을 통해 순진, 메모리, 이펙터 T 세포 iTregs의 결과로 인구는 유전자 발현이나 하나의 인간의 말초 혈액 기증자로부터 파생 세포의 인구 사이의 기능 비교를 용이하게합니다. 우리 손으로 정렬 세포가되었습니다microarray 및 주요 신호 이벤트를 검토 서부 blots의 유전자 변화를 측정하기 qRT-PCR 분석에 비해, 또는 패치에 기능적으로 이온 채널 사용 ¹⁴ 측정 클램핑.

Google 시스템은 중앙 프레임 워크 및 판독 주변의 분화 과정의 주요 측면을 조정하는 기능의 추가 혜택을 제공합니다. 따라서, 하나는 사전 정렬 PBMCs은 세포의 입력 인구를 변경하거나 배지에 작은 분자 억제제와 리간드를 포함시킬 수 있습니다. 하나도 overexpress 또는 아래로 똑 관심 단백질을하거나 기자가 만들지 도입 세포를 transfect 수 있습니다. 추가 혜택로서, 우리는 생성된 iTregs의 비율을 최대화하기 위해 문화의 조건을 변경할 수 있습니다. 전반적으로, 이러한 인간의 기본 T 세포 문화는 murine 시스템에서 만든 것보다 훨씬 더 생리적 관련성을 가지고있는 매우 강력한 실험적인 플랫폼을 delineates. 중요한 것은, 그것은 또한 직접적인 치료 가치를 유지할 수 있습니다. 실제로, 달 등t 현재 Treg 기반의 치료 방법은 체외 또는 세포의 전직의 생체내 개발이나 조작에 참여, 우리의 시스템은 치료의 표준으로 세포 치료를 Treg의 포함을 향한 도로에 중요한 통로로 볼 수 있습니다. 이 시스템의 향후 확장 오히려 설명 polyclonal 활성화보다 생체내 염증성 항원의 특정과 만남시 활성화 될 재단사 Tregs됩니다.