Generering af inducerede regulatoriske T-celler fra primære humane naive og memory T-celler

Summary

Beskriver vi en fremgangsmåde til generering af regulering, hukommelses-og naive T-celler fra en enkelt human bloddonor. Polariseret tregs kan derefter sammenlignes med andre delmængder i forskellige genetiske og funktionelle anvendelser med genetisk ensartethed, herunder suppression assay også beskrevet her.

Abstract

Udvikling og vedligeholdelse af immunosuppressive CD4 ⁺ regulatoriske T-celler (tregs) bidrager til den perifere tolerance er nødvendig for at forblive i immunologisk homeostase med den store mængde af selvstændige og kommensale antigener i og på den menneskelige krop. Forstyrrelser i balancen mellem tregs og inflammatoriske konventionelle T-celler kan resultere i immunopatologi eller cancer. Selv terapeutisk injektion af tregs har vist sig at være effektiv i murine modeller af colitis ^1, type I diabetes ^2, rheumatoid arthritis og graft versus host-sygdom, ⁴ flere fundamentale forskelle i human versus muse Treg biologi ⁵ hidtil udelukket klinisk anvendelse. Manglen på tilstrækkeligt mange renhed, stabilitet og homing specificitet terapeutisk tregs nødvendiggjorde en dynamisk platform af human Treg udvikling som at optimere betingelserne for deres ex vivo-ekspansion ^6.

Her d kanescribe en fremgangsmåde til differentiering af induceret tregs (iTregs) fra et enkelt humant perifert blod donor, som kan opdeles i fire faser: isolering af perifere mononucleære blodceller, magnetisk udvælgelse af CD4 ⁺ T-celler, in vitro celledyrkning og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) af T-celledelmængder. Idet Treg signaturen transkriptionsfaktoren gaffelhoved boks P3 (foxp3) er en aktiverings-induceret transkriptionsfaktor i mennesker ⁷ og ingen anden unik markør eksisterer et kombinatorisk panel af markører skal anvendes til at identificere T-celler med suppressor-aktivitet. Efter seks dage i kultur, kan celler i vores system kan afgrænses i naive T-celler, hukommelses-T-celler eller iTregs baseret på deres relative ekspression af CD25 og CD45RA. Som hukommelses-og naive T-celler har forskellige rapporterede polarisationsniveauer krav og plasticities ^8, forsortering af den oprindelige T-cellepopulation i CD45RA ⁺ og CD45RO ⁺ delmængder kan Be bruges til at undersøge disse forskelle. I overensstemmelse med andre vores CD25 ^Hi CD45RA ^- iTregs eksprimerer høje niveauer af foxp3 ^9, GITR og CTLA-4 ¹¹ og lave niveauer af CD127 ^12. Efter FACS for hver population, kan resulterende celler anvendes i et suppressor assay, som evaluerer den relative evne til at forsinke udbredelsen af ​​carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE)-mærkede autologe T-celler.

Protocol

1. Isolering af humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) fra fibrinlag

1. Opnå en enhed af buffy coat fra hospitalet eller i nærheden af ​​blod centrum. Vores blod center giver os med omkring 40-60 ml buffy coat pr opnået fra normale bloddonorer.
2. Hæld blodet i en autoklaveret 500 ml glasflaske indeholdende sterilt PBS til fortynding buffy coat. Det endelige volumen af ​​PBS + buffy coat være 250 ml.
3. Fylde ti 50 ml koniske rør med hver 20 ml Lymphoprep opløsning.
4. Forsigtigt overlejre Lymphoprep løsning med 25 ml af den fortyndede buffy coat, pas på ikke at forstyrre Lymphoprep løsning.
5. Spin rør i 30 minutter ved stuetemperatur ved 500 x g. Sørg for at slukke for centrifugens bremse, så de ikke forstyrre lymfocytfraktionen.
6. Samle PBMC'er ved grænsefladen mellem Lymphoprep og plasma-medium lag med en pipette. Aspirer plasma-medium slukket, indtil cirka 1 mlstadig dækker buffy coat-laget, der indeholder PBMC'er. Anvende en 10 ml pipette til overførsel af PBMC'er til et nyt 50 ml rør.
7. Vask cellerne to gange med PBS og derefter resuspenderes cellerne i 50 ml kold RPMI til tælling på et hæmocytometer. Typisk opsving er 8 x 10 ⁸ - 1 x 10 ⁹ PBMC'er.

Denne procedure kan skaleres ned til mindre mængder af blod. Fortynding af prøver af helblod er 1:01 i PBS.

2. Magnetisk negativ selektion af i alt CD4 ⁺ T-celler, CD4 ⁺ CD45RA ⁺ naive T-celler eller CD4 ⁺ CD45RO ^{+-hukommelses-T-celler} fra PBMC'er ved hjælp EasySep Enrichment Kits (Stem Cell Technologies)

Skridt til at følge i 1 x 10 ⁸ til 4,25 x 10 ⁸ PBMC'er.

1. Resuspender PBMC'er til en slutkoncentration på 5 x 10 ⁷ per ml i PBS indeholdende 2% FBS og 1 mM EDTA. Flytte cellerne til et frisk 14 ml polypropylen rundbundet røret.
   Isolering af totalt humant CD4 ⁺ T-celler ved negativ selektion: tilføj humane CD4 ⁺ T-celle berigelse Cocktail af antistoffer (50 pi pr ml PBMC'er), blandes og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
   1. Isolering af humane naive T-celler ved negativ selektion: tilsættes 50 pi anti-CD45RO antistof pr ml PBMC cellesuspension, blandes og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur. Tilsættes tilsætning cocktail forsynet med kittet (50 pi pr ml PBMC'er), blandes og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter.
   2. Isolering af humane memory T-celler ved negativ selektion: tilføj humane memory CD4 ⁺ T-celle berigelse Cocktail af antistoffer (50 pi pr ml af PBMC'er), blandes og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
2. Bland magnetiske partikler godt til lige distribuere dem hele løsningen. Må ikke vortex nanopartikler fra naive kit.
3. Tilsættes de magnetiske partikler (100 ul pr ml PBMC'er til den samlede CD4 ⁺ og naive T-celle udvælgelse 50 pi per ml af PBMC'er til hukommelses-T-celle selektion). Blanding ved forsigtigt at pipettere 2-3 gange og inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter for naive T-celle udvælgelse eller 5 minutter for hukommelses-eller total CD4 ^+-T-celle udvælgelse.
4. Tilsættes PBS indeholdende 2% FBS og 1 mM EDTA for at bringe volumenet op til 10 ml per rør. Bland ved forsigtigt at pipettere 2-3 gange, før placere reducerede rør i sølv EasySep magnet for 5, 10 eller 2,5 minutter for total CD4 ⁺ T-celler, naive og memory delmængder, hhv.
5. Med røret stadig EasySep magnet, hældes væske ind i nye 50 ml rør til at isolere cellerne af interesse.
6. Gentag trin 2.5 og 2.6 for bedre opsving.

3. Cellekultur betingelser for at inducere regulatoriske T-celler

1. Dagen før trin 1 og 2 coat vævskulturplader ved først at fortynde anti-CD3-antistof (OKT3 klon) til en koncentration på 1 ug / ml i sterilt PBS. En 6-brønds plade tilsættes 2 ml PBS + anti-CD3 per brønd i en 12 brønds plade tilsættes 1 ml eller en 24-brønds plade tilsættes 500 pi per brønd. Holde den overtrukne plade ved 4 ° C indtil anvendelse.
2. Forberede polarisation medium ved tilsætning af 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 50 uM β-mercaptoethanol til RPMI-1640 før suppleret med 2,06 mM Glutamax-I og 25 mM HEPES-buffer. Dernæst tilsættes 2 ng / ml TGF-β og 5 ng / ml IL-2. Her kan man tilføje ligander eller inhibitorer af interesse for medierne. Resuspender cellerne fra trin 2 i en koncentration på 2 x 10 ⁶ celler / ml polarisering medium.
3. Præ-varme plader ved 37 ° C og aspireres PBS af anti-CD3-overtrukne brønde før tilsætning celler. Tilsæt 4 ml per brønd af cellesuspension for en 6-brønds plade, 2 ml af celler i en 12 brønds plade eller en ml af celler i en 24 brønds plade. Fyld op tomme brønde med PBS for at reducere fordampningen afmedier. Inkuberes i 3 dage ved 37 ° C / _5% CO2.
4. På dag 3 efter udpladning, vågeblus plade i en centrifuge i 5 minutter ved 500 x g. Uden at forstyrre T-celler på bunden af ​​pladen, fjerne halvdelen af ​​mediet og erstattes med frisk medium. Alternativt, hvis godt bliver overfyldt med celler (koncentration over 3 x 10 ⁶ / ml), opdeles den mængde ligeligt i et andet anti-CD3 coatede plade, og der tilsættes frisk medium tilbage til det oprindelige volumen. Inkuberes i to til tre yderligere dage ved 37 ° C / _5% CO2.

4. Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) af de tre populationer af T-celler

1. Forberede FACS vaskepuffer ved tilsætning af 0,5% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA til sterilt PBS. Sted buffer ved 4 ° C for at fryse.
2. Fjerne celler fra cellekultur brønd og skylles hver brønd med 2 ml PBS for at sikre fuldstændig celleindvinding. Placere alle cellerne i 50 ml polypropylenrør og centrifugeres ved 500 xg i 10minut ved 4 ° C.
3. Tæl cellerne på et hæmocytometer at bestemme celledensitet.
4. Sted 3-5 x 10 ⁵ celler pr røret i fire separate 5 ml rundbundet polystyrenrør til erstatning kontroller. Anbring resterende celler i 50 ml polypropylenrør og ikke mere end 35 x 10 ⁶ celler pr rør.
5. Vågeblus celler i 5 minutter ved 4 ° C og aspirat medier. Resuspender celler, der skal sorteres i 90 pi kold vaskebuffer per 1 x 10 ⁶ celler. Resuspender i 100 pi kold vaskebuffer de kompensationskontrol rørene.
6. De celler, der skal sorteres, 2 pi anti-CD25-PE, 3 pi anti-CD45RA-PE-Cy5 og 1 pi anti-CD127-APC pr 1 x 10 ⁶ celler kombineres. Tilsættes intet antistof til det første kompensationskontrol rør, 2 pi anti-CD25-PE til det andet rør, 3 pi anti-CD45RA ^- PE-Cy5 til det tredje rør og1 pi anti-CD127-APC til fjerde rør. Inkuber alle rør på is i 45 minutter i mørke.
7. Aspirer buffer og resuspender cellerne i en koncentration på 1 x 10 ⁷ celler pr ml vaskepuffer. Tilsættes 1,5 pi DNase II per ml af celler før filtrering gennem en 40 uM nylon cellefilter. Flytte cellerne til flere 5 ml rundbundet polypropylenrør med ikke mere end 3,5 ml pr rør. Resuspender kompensationskontrol celler i 300 pi vaskepuffer.
8. Sæt kompensation på MoFlo flowcytometer for at minimere tværs detektion af PE, APC og PE-Cy5 filtre. Indstillet porte til at sortere iTregs (CD25 ^Hi CD127 ^-/LOW CD45RA ^- celler), naive (CD25-CD45RA ⁺⁾ og hukommelsen (CD25 ^- CD45RA ^-) T-celler i 5 ml rundbundet polystyrenrør indeholdende 1 ml serum fra nyfødt kalv.

5. Suppression Assay

1. Gør suppression assaymedier ved tilsætning af 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 5 ng / ml IL-2 og 2 ng / ml TGF-β på AIM-V.
2. Dagen for assayet, oprense heterologe CD4 ⁺ T-celler fra fibrinlag som angivet i trin 1 og 2. Disse vil blive målcellerne for undertrykkelse assayet og ikke indeholder CD25 ⁺ Treg celler, som det kan ses i figur 2, dag 0.
3. Mærkning af celler med CellTrace kit ifølge producentens instruktioner, bortset fra anvendelse af kun en pi 5 mM stamopløsning pr ml celler i stedet for 2 ul. Holde ud fra direkte lys, tilsættes 18 pi DMSO leveret af CellTrace kit til et hætteglas CFSE til fremstilling af en 5 mM stamopløsning. Resuspendere det ønskede antal målceller (til et maksimum på 1 x 10 ⁷⁾ i forvarmet PBS + 0,1% (w / v) BSA til en slutkoncentration på 1 x 10 ⁶ celler / ml. Tilsættes 1 ml af 5 mM CFSE per ml celler og inkuberes i et 37 ° C vandbad i 5 minutes. Tilsættes 5 volumener af fuldstændig iskold RPMI med 10% FBS for at standse farvning og inkuberes på is i 5 minutter. Vask cellerne to gange mere med kold komplet RPMI og resuspender 1 x 10 ⁵ celler pr 100 pi suppression assaymedier.
4. Treg suppression inspektør perlerne med en stamkoncentration på 2 x 10 ⁷ perler / ml. Pellet et antal perler lig det totale antal celler pr eksperiment ved hurtig centrifugering i en Eppendorf-rør. Vaskes perlerne en gang med RPMI og re-pellet. Efter aspiration af RPMI, således Resuspender perler at en passende mængde perler per brønd er 8 pi undertrykkelse assaymedier.
5. Til en 96-brønds rundbundet vævsdyrkningsplade, CFSE-farvede celler (1 x 10 ⁵ celler / ml), inspektør perler og polariseret og sorterede celler (1 x 10 ⁵ celler / ml) i friske suppression assaymedier tilføje et ønsket mål (CFSE farvet): effektor (sorteret)-forholdet i et slutvolumen på 200 ul. Alle betingelser er angivet i tripliCates.
6. Fremstilling af den første af to kontrol betingelser ved tilsætning af 100 pi CFSE farvede celler, 8 pi inspektør perler og 1 x 10 ⁵ af friske, ikke-farvede celler i 92 pi suppressor assay medium per brønd. Forberede den anden kontrol med de samme cellulære komponenter som ovenfor, men uden Treg inspektør perler.
7. Dækplade i aluminiumsfolie og inkuber ved 37 ° C / _5% CO2 i fem dage.
8. I mørke opsamle cellerne fra hver brønd ved pipettering og anbringes i en 5 ml rundbundet polystyrenrør. Centrifugeres cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved 4 ° C, opsug medier og resuspenderes i 300 gl koldt FACS vaskepuffer fra trin 4. Analysere den første 3 x 10 ⁴ CFSE ⁺ begivenheder fra levende lymfocytporten repræsenterer målceller i et histogram med Cell Quest-software.

6. Repræsentative resultater

Eksempel på flowcytometriske pseudofarve dot plots over en fem dages tid-couRSE overvågning iTreg differentiering baseret på den relative co-ekspression af CD25 med foxp3 kan CTLA-4 og CD45RA ses i figur 2. Histogrammet i figur 3 viser en vellykket suppression assay, hvori sorteret iTregs (CD25 ^Hi CD45RA ^- CD127 ^-/LOW celler). Er de eneste undersæt af en fem-dages kultur, der har erhvervet regulering / suppressor evne Figur 4 viser induktionen af tregs fra en naiv T-celle pool (top-paneler) og en hukommelse, T-celle pool (nederste paneler), efter fem dages kultur i standard iTreg medium. CFSE farvning af de første celler, viser, at enten naive (øverst til højre panel) eller memory-T-celler (nederste højre panel) differentiere til iTregs (højeste foxp3-udtrykkende celler) efter flere runder af celledeling.

Figur 1. Skematisk af eksperimentel procedure. PBMC'er are adskilt fra humant perifert blod via gradient centrifugering før magnetisk negativ selektion af CD4 ⁺ CD25 ^- T-celler. Efter fem til seks dage i kultur, undergår celler FACS og co-inkuberet med heterologe CFSE mærkede målceller at måle suppressor-aktivitet.

Figur 2 Oprensede humane primære CD4 ⁺ CD25 ^-. T-celler dyrkes i iTreg medium. En aliquot af celler opsamles umiddelbart efter isolering (dag 0) og på dag 1, 3 og 5 i cellekultur for at overvåge forløbet af CD45RA, foxp3, CTLA-4 og CD25 markører. Den iTreg profil svarer til CD45RA ^-, foxp3 ^Hej, CTLA-4 ^Hej og CD25 ^Hi (fremhævet i in-graf vindue).

Figur 3. Oprenset CD4 ⁺ CFSE labeled celler (1 x 10 ⁵ / brønd) dyrkes med Treg suppression inspektør perler i nærvær af sorterede naive, hukommelses-eller iTreg celler (3 x 10 ⁴ / brønd). Efter fem dage blev celler høstet, og CFSE profilen af ​​de farvede celler analyseres ved strømningscytometri. Tilstedeværelsen af iTreg celler fuldstændigt ophæver proliferationen af CD4 ⁺ T-celler. Numre indikerer procentdelen af ​​CFSE-mærkede celler, der har undergået division.

Figur 4 Oprenset human primær naive. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ og hukommelsen (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ^+)-T-celler farves med CFSE og dyrket i iTreg medium. Efter fem dage blev celler fænotypebestemt og celledeling hastigheder estimeres. Som angivet i figur 2 iTreg undersæt differentieres fra begge delmængder svarer tilCD45RA ^- CD25 ^Hi foxp3 ^Hi og CTLA-4 ^Hi (de to sidstnævnte ikke vist). Sammenlignende CFSE farvning profiler identificere iTregs (her de højeste udtrykker foxp3 T-celler) som de mest proliferative celler i løbet af fem-dages kultur.

Discussion

Mens Treg overførsel besidder enorm terapeutisk løfte i bekæmpelsen af ​​autoimmunitet transplantatafvisning og andre immune eller inflammatoriske-medieret sygdomme, metoder til deres effektive generation og stabil vedligeholdelse er endnu ikke blevet udviklet. Da kun 1-5% af cirkulerende humane T-celler er tregs, kontrolleret ekspansion og differentiering overvinder denne mangel som en stor afskrækkende for gennemførelsen af ​​tregs ind på klinikken. På den anden side, som vi lærte fra TGN1412 forsøget ¹³ Det er videnskabeligt og etisk nødvendigt at dybt forstå de molekylære begivenheder, der orkestrere menneskelige T-celle skæbne beslutninger, inden der gennemføres nogen terapeutisk regime. Med denne fremgangsmåde iTreg differentiering lette de resulterende populationer af naive, hukommelse effektor T-celler og iTregs genekspression eller funktionelle sammenligninger mellem populationer af celler, som stammer fra en enkelt humant perifert blod donor. I vores hænder, har sorteret celler væretsammenlignet med microarray og QRT-PCR analyser til at måle genetiske ændringer, i western blots at undersøge vigtige signalsystemer begivenheder, eller i patch fastspænding til funktionelt måle ion-kanal brug ^14.

Vort system giver den yderligere fordel af evnen til at manipulere vigtige aspekter af differentieringsprocessen omkring en central ramme og udlæsning. Således kan man forsortere PBMC'er at ændre input population af celler eller omfatte småmolekylære inhibitorer og ligander til dyrkningsmediet. Man kan også transficere celler at overudtrykke eller vælte et protein af interesse eller indføre en reporter konstrukt. Som en yderligere fordel, kan vi ændre betingelserne i kultur til at maksimere procentdelen af ​​dannet iTregs. Samlet set human primær T cellekultur afgrænser en meget robust eksperimentel platform med en fysiologisk relevant meget større end dem, der skabes i murine systemer. Vigtigere, kan den også opretholde en direkte terapeutisk værdi. Som MOSt aktuelle Treg-baserede terapeutiske tilgange involverer in vitro-eller ex vivo udvikling eller manipulation af celler, kan vores system ses som en vigtig kanal på vejen mod integration af Treg celleterapi i standard af pleje. Fremtidige udvidelser på dette system vil skræddersy tregs at blive aktiveret efter møde med specifik in vivo inflammatoriske antigener i stedet for polyklonale beskrevet aktivering.