Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.
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Artículo de método
La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo y mantenimiento de las células CD4 + inmunosupresores células T reguladoras (Tregs) contribuir a la tolerancia periférica necesaria para permanecer en homeostasis inmunológica con la gran cantidad de antígenos propios y comensales en y sobre el cuerpo humano. Las perturbaciones en el equilibrio entre las células T reguladoras y células T inflamatorias convencionales puede resultar en la inmunopatología o el cáncer. Aunque la inyección terapéutica de Tregs ha demostrado ser eficaz en modelos murinos de la colitis 1, diabetes tipo I 2, la artritis reumatoide y enfermedad de injerto contra huésped, 4 varias diferencias fundamentales en humanos versus ratón TREG biología 5 hasta ahora ha impedido el uso clínico. La falta de número suficiente, la pureza, la estabilidad y la especificidad de recalada terapéutico Tregs necesaria una plataforma dinámica de desarrollo TREG humana en la que para optimizar las condiciones para su expansión ex vivo 6.
Aquí Describe un método para la diferenciación de las células T reguladoras inducidas (iTregs) a partir de un solo donante de sangre periférica humana que se puede dividir en cuatro etapas: el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica, la selección magnética de células T CD4 +, en el cultivo celular in vitro y activadas por fluorescencia clasificación de células (FACS) de subconjuntos de células T. Puesto que la transcripción TREG firma factor de forkhead P3 caja (FoxP3) es un factor de transcripción inducida por activación en los seres humanos 7 y ningún otro marcador único existe, un panel de combinatoria de marcadores debe ser utilizado para identificar las células T con actividad supresora. Después de seis días de cultivo, las células de nuestro sistema pueden ser demarcadas en las células T ingenuas, las células T de memoria o iTregs en función de su expresión relativa de CD25 y CD45RA. Mientras que las células T ingenuas de memoria y tienen diferentes informes sobre las necesidades de polarización y plasticidades 8, pre-clasificación de la población de células T inicial en CD45RA + y CD45RO + subconjuntos puede be utiliza para examinar estas discrepancias. De acuerdo con los demás, nuestra CD25 Hola CD45RA - iTregs expresar altos niveles de FoxP3 9, GITR y CTLA 4-11 y bajos niveles de CD127 12. Tras FACS de cada población, las células resultantes pueden ser utilizados en un ensayo supresor que evalúa la capacidad relativa para retardar la proliferación de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)-etiquetados células T autólogas.
Protocolo
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de capa leucocitaria
- Adquirir una unidad de la capa leucocitaria del hospital o las inmediaciones del centro de sangre. Nuestro banco de sangre nos da alrededor de 40-60 ml de la capa leucocitaria obtenida por unidad de donantes de sangre normales.
- Verter la sangre en un frasco de vidrio esterilizado 500 ml que contiene PBS estéril para diluir la capa leucocitaria. El volumen final de PBS + capa leucocitaria debe ser de 250 ml.
- Llenar diez tubos cónicos de 50 ml cada uno con 20 ml solución Lymphoprep.
- Suavemente superponer la solución Lymphoprep con 25 ml de l....
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Discusión
Si bien la transferencia TREG es una gran promesa terapéutica para combatir el rechazo del injerto autoinmunidad y otros trastornos inmunes o inflamatorias mediadas, métodos para su generación eficiente y el mantenimiento estable todavía no se han desarrollado. Dado que sólo el 1-5% de la circulación de las células T son células T reguladoras, su expansión controlada y la diferenciación supera esta escasez como un importante elemento de disuasión de la aplicación de células T reguladoras en la clínica. Por otro lado, co.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Jennifer Strange y Bauman Greg por su ayuda con el análisis de citometría de flujo y clasificación. Este trabajo fue apoyado por el Número de Subvenciones del NIH 2P20 RR020171 de la CNRR y por la Universidad de Kentucky de los fondos de inicio de FM; GIE reconoce el apoyo de la Beca de Postgrado y la Beca Presidencial de Oportunidades de Kentucky.
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Materiales
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Mantener a temperatura ambiente |
| Refrigerada de sobremesa Centrífuga | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocitómetro | Hausser Científico | 3110 | |
| EasySep Humanos células T CD4 + Kit de enriquecimiento | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep CD4 + de memoria Humanos de las células T del kit de enriquecimiento | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Humanos ingenuo CD4 + células T del kit de enriquecimiento | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy Mag EasySepneto | Stem Cell Technologies | 18001 | Plata |
| Redondo de 5 ml tubos de la base de poliestireno | BD Falcon | 352008 | |
| 15 ml Tubos de centrífuga de polipropileno | VWR | 89004-368 | |
| 14 de polipropileno ml de fondo redondo de Tubos | BD Falcon | 352059 | |
| 50 ml Tubos de centrífuga de polipropileno | VWR | 89004-364 | |
| Humano anticuerpo anti-CD3 | Bio X de la célula | BE0001-2 | Clon: OKT3 |
| 24 de poliestireno de cultivo celular Plata | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Pues bien tejido de fondo redondo cultivo en placa | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 con Glutamax-I y tampón HEPES | Gibco | 72400 | |
| Suero fetal bovino (SFB) | Gibco | 16000 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma | M7522 | |
| Humana Recombinante TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Humana Recombinante de IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Albúmina de Suero Bovino (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| EDTA 0,5 M | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clon: 4E3 |
| Ratón anti-humano CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clon: HI100 |
| Ratón anti-humano CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clon: MB15-18C9 |
| DNasa II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo citómetro de flujo | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Árbol Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Suero de ternera recién nacido | Gibco | 16010 | |
| L-glutamina | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CFSE CellTrace Proliferación Celular Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg perlas de supresión de Inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| La penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140 | |
| 40 mM de nylon cepa celularer | BD Falcon | 352340 |
Referencias
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V.
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Reimpresiones y permisos
