1. Stalde og akklimatisering Procedures Mandlige og kvindelige CD-1 mus er opstaldet med samme køn søskende, op til 5 dyr pr bur, i standard plastbure indeholder beta chip sengetøj og nestlet pads, med trådgitteret låg til at rumme vandflasker og fødevarer. Standard musefoder og vand er tilgængeligt ad libitum i bure i hele eksperimentet. Mus holdes på en omvendt lys-mørke-skema (lys på fra 22:00 til 10:00). Mus får lov til at akklimatisere til IVSA test rum i en uge forud for starten af eksperimentelle procedurer. 2. Operant træning Alle adfærdsmæssige procedurer, herunder sødet mælk træning og stiknarkomaners selvadministration sessioner udføres ved hjælp operantkamre måler 15,9 x 14 x 12,7 cm, der er udstyret med 2 ultra-følsomme mus løftestænger, dipper kopper, stimulus lys og mikroliter sprøjtepumper (Med Associatesates Inc., St. Albans, VT, USA). Chambers er forbundet med en computer ved hjælp Med Associates Smart CR-interface og Med-PC-software til at programmere tidsplanen for forstærkning og indsamler data. Naive mus er vant til de operantkamre og trænet til at løftestang presse under anvendelse af en sødet mælk belønning (0,1 ml), der præsenteres i en dipper kop. Operant mælk træning gennemføres i 1-hr sessioner i 5-7 dage. Afslutning af et fast forhold (FR) tidsplan på den aktive arm resulterede i præsentationen af dipper kop og belysningen af en stimulus lys. Det sødede mælkeopløsning bestod af sucrose (10 mg / ml, ACS Reagent, Sigma-Aldrich Inc. St-Louis MO, USA) tilsat til sødmælk (3,25% fedt). Operant træning med en sødet mælk opløsning eller en flydende føde forstærker er en udbredt teknik til at lette operant reagere på mus 1,2. 3. Fremstilling af udstyr til brug under kirurgi RequIRED udstyr – 20, 23 og 26 gauge nåle, grinder, 1 cc sprøjter, Tygon slanger, loddekolbe, heparin, antibiotika og smertestillende. Udarbejde en nål til at styre indføringen af kateteret i halsvenen ved barbering ned en 20 gauge nål. Akslen af nålen er barberet ned med en slibemaskine til dannelse af en kanal inde i nålen til at lede kateterrøret ind i venen. Nålen kanal skal omhyggeligt kontrolleres for enhver metalaffald, som kan være blevet deponeret. Eventuelle forhindringer til kanalen skal skrabes ved hjælp af fine spids tang. Tilpasse to 1-cc sprøjter, der skal benyttes til skylning og kontrol af kateteret. Forbered to sprøjter ved at tage 12 cm stykker af Tygon-røret og fastgøre dem ved den ene ende til 26 gauge nåle fastgjort til 1 cc sprøjter, og strækker den anden ende af røret over 23 gauge nåle. En sprøjte skal fyldes med 0,9% sterilt saltvand og den anden med en hepariniseret ticarcillin opløsning (33 mg ticarcillinog 0,3 mg heparin per 10 ml sterilt saltvand). Forbered kateterkanylen caps. Tygon-røret strækkes over en 23 gauge nål, og skåret 1 cm fra facet. Smelt den åbne ende af røret for at skabe en tyk tætning. Slangen skal smeltes, således at hele kanylen hætte er lang nok til at passe over kateterkanylen, med den lukkede ende slutter helt over enden af kanylen. Bemærk, at hvis hætten er for lang, er der risiko for, at den vil blive bøjet og efterfølgende gennemboret under processen med fastgørelse af skrue på kateteret dækker. Således omhyggelige forberedelse af katetret hætter anbefales, for at tilvejebringe en god pasform til kanylen. Forbered den nødvendige løsninger. Alle reagenser købt hos Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, USA). Hepariniseret ticarcillin opløsning kateter skylning – opløses 0,33 g ticarcillin (dinatriumsalt) og 0,003 g heparin i 10 ml sterilt saltvand. 0,03 ml af opløsningen skylles thrgående kateteret dagligt. Den antibiotiske opløsning administreres til at forebygge blodpropper og infektioner i at udvikle sig. Amikicin (antibiotika) til subkutan injektion – En enkelt subkutan injektion gives efter kirurgi i en dosis på 10 mg / kg for at forhindre postoperative infektioner. Ketoprofen (analgetikum) til subkutan injektion – En enkelt subkutan injektion gives efter kirurgi i en dosis på 5 mg / kg til at håndtere enhver postoperativ smerte. 4. Kateter implantering Nødvendigt udstyr og reagenser: Isofluran, sterilt saltvand, alkohol (70%), 1 og 3 cc sprøjter fyldt med sterilt saltvand, 1-cc tilpassede sprøjter, antibiotika og smertestillende opløsninger fremstillet i afsnit 3 ovenfor, mus katetre (CamCaths, Cambridgeshire, UK ), kateter covers (krystal hætter fra HRS Scientific, Montreal, Quebec), øje smøremiddel, 4 cm plast bar at ophøje blodåre (dettekan være fremstillet af en plast vatpind), polysporin, sterile vatpinde og gaze, buede og lige pincet, arterie klemmer, fine sakse. Hjælp af aseptiske standardteknikker den kirurgiske bænk, de kirurgiske instrumenter, og katetrene er steriliseret forud for operationen. Korrekte steriliseringsteknikker indbefatter damp autoklavering i de kirurgiske instrumenter og katetere købt fra CamCaths. Glasperle sterilisering kan også anvendes på spidsen af de kirurgiske instrumenter. Ethylenoxidsterilisering kan anvendes på mere sarte katetre eller materialer, som risiko smeltning. En mere detaljeret beskrivelse af gnaver kirurgiske aseptiske teknikker kan findes i vedlagte referencer 1,2. Opsætning af bænken, er instrumenter og næse kegle til vedligeholdelse af anæstesi illustreret i billedet. Mus er bedøvet med isofluran gas og holdt under anæstesi ved anvendelse af en vejrtrækning rør under et udsugningssystem. Eye smøremiddel (Tears Naturale PM) påføres på begge øjne for at forhindre dem i at tørre ud under proceduren. Et passende kirurgiske margin er barberet på dyrets ryg og omkring halsen. Før nogen indsnit er lavet, er de kirurgiske områder begrænses vha. sterile forhæng. For at fremstille katetret til indføring i det højre atrium af hjertet, det overskydende kateterrøret afskåret 1,2 cm fra pæren af katetret. Dette er den optimale længde fastsat for voksne CD-1-mus, 8 uger gamle, 20-25 g legemsvægt. Længden af kateterrør kan være nødvendigt at justere en smule (ved forsøg), ud fra stammen, størrelse og alder af musene. Før indsættelse, er sprøjte indeholdende steril saltopløsning (afsnit 3.2) fastgjort til kateterkanylen, og kateteret skylles og kontrolleres for lækager. Holddenne sprøjte er fastgjort til kateteret under hele den kirurgiske procedure. Det vil blive brugt til at skylle kateteret, og trække tilbage blod i trin 4,7. Efter sterilisation i 70% alkohol, en 2 cm lang midscapular snit begynder midt på ryggen og slutter lige under halsen for at rumme bunden af kateteret. Bindevæv skal tvinges fra hinanden med en pincet for at gøre plads for kateteret bund under huden. At anbringe dyret på ryggen, en anden flad 1-2 cm diagonal incision i højre nøgleben går opad til dyr kæbe, efter at området er blevet penslet med 70% alkohol. Halsvenen vil blive fundet overfladisk under huden af halsen. Som forberedelse til indføring af kateteret, er røret fra bunden af kateteret trækkes gennem indsnit på ryggen og bringes tæt på halsvenen ved at lede slangen under huden lidt over den højre skulder. Enden af kateterrøret erderefter fastgjort til en arterie klemme og placeret i dyrets side for at holde den på plads. Den højre halsvene er placeret ved forsigtigt at bevæge sig væk overfladisk binde-og fedtvæv fra snit omkring dyrets hals. Bindevævet omkring venen er brudt fra hinanden ved hjælp af buede pincet og venen derpå hævet under anvendelse af en steril plastik bar. Løse åbne sutur knob er lavet rundt om hver ende af venen og kateterrøret er ført gennem den øverste knude og sløjfes over suturtråd at hvile løsnet over den højre skulder. Før indføring, våde både 20 gauge indføringsnålen og vene med sterilt saltvand for at reducere friktion. Nålen holdes parallelt med venen, og indsættes forsigtigt nær bunden af den forhøjede vene (Bemærk: cirka 0,5 cm af nålespidsen skal indtaste den vene). Ved hjælp af en pincet, kateterrøret glide ned skaftet af kanylen i venen. Resistens tyder på, at røret is inden for bindevæv og ikke i venen. Skub 0,03 cc af saltvand gennem venen at sikre, at der ikke er utætheder. Utætheder ville indikere, at venen kan gennemhulles eller at kateterrøret placering skal justeres. Bemærk: For at kontrollere, om slangen er i venen, forsøge at udarbejde nogle blod på vedlagte saltvand sprøjte. Hvis blodet ikke umiddelbart kan opstilles, kan venen eller hjerte væg være okkludere kateterspidsen, eller venen er ikke blevet gennemboret, justere røret og prøve igen. Needle reinsertion kan være nødvendig, hvis blod stadig ikke kan udarbejdes. For at sikre kateteret på plads, skubbes kateteret pæren til indsætningspunktet og fjern nålen. Bind den nederste knude og derefter trække kateteret flugter baren før binde den anden knude lige over pæren. Test igen for at se, om blodet kan trækkes op og løsne knuderne lidt, hvis nødvendigt. Tuck kateterrøret under huden og suturventrale snit omkring dyrets hals. Anvende Polysporin helbrede hurtigt med en steril vatpind eller en anden antibiotisk salve fortrinsvis indeholdende noget analgetikum til den lukkede incision. Med dyret på dets underliv, placere kateteret base under huden på ryggen i den forberedte indsnit. Sørg for, at overskydende slange minimalt er ført og godt skjult under kateteret basis for at minimere risikoen for at dyret tygger og piercing det. Sy snit på begge sider af kateteret base, og anvende Polysporin helbrede hurtigt under anvendelse af en steril vatpind. Skyl kateteret med 0,03 cc af den hepariniserede ticarcillin løsning ved hjælp af sprøjten med slangen fastgjort til det (afsnit 3,2). Cap kanylen med plastikkanylen og skru på den hvide kateter dæksel. I nogle mus, som er frisk fra kirurgi kan blod løbe ud af kateteret før kanylen er udjævnet. Det er vigtigt at re-skylle dyret og rapidly udskifte kanylen hætte før blod har mulighed for at strømme ud. Dyrene skal skylles på daglig basis for at opretholde kateter åbenhed. Efter aftørring ned injektionen området mellem dyrene bagben med 70% ethanol, injiceres subkutant den analgetiske ketoprofen i en dosis på 5 mg / kg på den ene side, og det antibiotiske amikicin i en dosis på 10 mg / kg på den anden side. Efter anæstesi afbrydes, har dyrene lov at komme sig i et rent bur med let adgang til foder og vand i 5 til 7 dage. Mus anbringes i et opvarmet skab natten over for at forhindre post-operative hypotermi. 5. Behavioural test – Intravenøs selvadministration Forud for adfærdsmæssige forsøg katetre skyllet med 0,9% sterilt saltvand. Mus derefter placered i operantkamre og forbundet med infusionen linjer og infusionspumper. Aktive håndtag presser resultere i en 3,2 sek 18 pi lægemiddelinfusion kombineret med belysningen af en stimulus lys. Hver løftestang presse er efterfulgt af en 8 sek timeout periode, hvor stimulus lyser. Efter den operant session, er mus katetre skylles med den hepariniserede ticarcillin løsning, før det returneres til deres hjem bur. Mus får lov til selv at administrere i 3 på hinanden følgende 2-timers sessioner på hver dosis. Doser blev præsenteret i tilfældig rækkefølge for hver mus, som vist i det følgende afsnit. Kateter åbenhed vurderes dagligt ved at sikre, at både saltvand og antibiotikaopløsning kan skylles gennem katetret. Desuden kan en ketamin / midazolam test udføres som beskrevet i vedlagte reference 5. Kort fortalt, tegn på anæstesi såsom immobilitet inden for 5 sek af en infusion af fra 0,02 til 0,03 ml ketamin (15 mg / ml)eller midazolam (0,75 mg / ml) midazolam er bevis på et patent kateter 5.