Metodi per l'auto-somministrazione per via endovenosa in un modello murino

Summary

L'auto-somministrazione per via endovenosa (IVSA) paradigma è considerato il gold standard nella esaminando le proprietà di rinforzo delle sostanze d'abuso nei roditori. Questo manoscritto descrive le procedure sperimentali e le tecniche chirurgiche necessarie per ottenere dati affidabili IVSA. In particolare, l'impianto del catetere meticolosa e la manutenzione sono evidenziati.

Abstract

I modelli animali sono stati sviluppati per studiare gli effetti di rinforzo di farmaci, tra cui l'auto-somministrazione per via endovenosa (IVSA) paradigma. I vantaggi di usare un paradigma IVSA per studiare le proprietà di rinforzo delle sostanze d'abuso come cocaina includono il fatto che il farmaco è auto-somministrato anziché sperimentatore-somministrato, il programma di rinforzo può essere alterato, e la misurazione accurata delle quantità di droga consumata così come i tempi e le modalità di IV iniezioni può essere ottenuta. Inoltre, la via di somministrazione endovenosa evita confonde potenziali connessi a metabolismo di primo passaggio o il gusto, e produce un rapido aumento nel sangue e livelli di farmaco cervello. Come indicato in questo video, auto-somministrazione per via endovenosa può essere ottenuta senza restrizione alimentare prima o la formazione di droga prima dopo il posizionamento del catetere durante l'intervento attento e meticoloso del catetere ogni giorno di lavaggio e manutenzione. Procedure sperimentali descritte in questocarta includere una descrizione di stabulazione degli animali e metodi di acclimatazione, la formazione operante con soluzioni latte zuccherato, e l'impianto chirurgia catetere.

Protocol

1. Di ricovero per animali e acclimatazione procedure

1. Maschio e femmina CD-1 topi sono alloggiati con persone dello stesso sesso fratellini, fino a 5 animali per gabbia, in normali gabbie in plastica contenenti biancheria beta chip e pastiglie nestlet, con coperchio a griglia metallica per ospitare bottiglie d'acqua e cibo. Standard del mouse cibo e acqua ad libitum disponibili nelle gabbie casa tutto l'esperimento.
2. I topi sono mantenuti su un reverse luce-buio di pianificazione (luci accese 22:00-10:00).
3. I topi possono acclimatarsi sale prova le IVSA per una settimana prima dell'inizio delle procedure sperimentali.

2. Formazione operante

1. Tutte le procedure comportamentali, compresa la formazione del latte zuccherato e per via endovenosa farmaci di auto-amministrazione sessioni vengono effettuate con camere di condizionamento operante di misura 15,9 x 14 x 12,7 cm, dotate di 2 ultra-sensibili leve del mouse, tazze bilanciere, luci di stimolo e pompe siringa microlitro (Med AssociAtes Inc., St. Albans, VT, USA). Chambers sono interfacciati ad un computer tramite Med Associates intelligente CR interfaccia e Med-PC software per programmare il calendario delle armature e raccogliere i dati.
2. Topi ingenui sono abituati alle camere operante e addestrati a premere la leva con una ricompensa di latte zuccherato (0,1 ml) ha presentato in una tazza mestolo. Formazione latte operante è condotto in 1 ora sessioni per 5-7 giorni. Completamento di un rapporto fisso (FR) orario sulla leva attiva portato alla presentazione della coppa bilanciere e l'illuminazione di una luce stimolo. La soluzione consisteva in latte zuccherato, di saccarosio (10 mg / ml, Reagente ACS, Sigma-Aldrich Inc. St-Louis MO, USA) aggiunto al latte intero (3,25% di grassi). Formazione operante con una soluzione di latte zuccherato o un rinforzo cibo liquido è una tecnica comune utilizzata per facilitare rispondere operante in ^1,2 topi.

3. Preparazione delle attrezzature da utilizzare durante l'intervento chirurgico

Required attrezzature - 20, 23 e 26 aghi calibro, smerigliatrice, 1 cc siringhe, tubi Tygon, saldatore, eparina, antibiotici e analgesici.

1. Preparare un ago per guidare l'inserimento del catetere nella vena giugulare di rasatura giù un ago da 20 gauge. L'albero dell'ago viene rasato utilizzando una smerigliatrice a formare un canale all'interno dell'ago per guidare il tubo del catetere nella vena. Il canale ago deve essere attentamente controllato per i residui metallici che potrebbero essere stati depositati. Eventuali ostacoli al canale deve essere prelevata con belle pinze a punta.
2. Adattare due 1-cc siringhe da utilizzare per il lavaggio e controllando il catetere. Preparare due siringhe prendendo 12 pezzi cm di tubo Tygon e di collegarli ad una estremità a 26 aghi calibro fissate alle siringhe da 1 cc, e si estende le altre estremità del tubo più di 23 aghi calibro. Una siringa deve essere riempita con 0,9% di soluzione salina sterile e l'altra con una soluzione eparinizzata ticarcillina (33 mg di ticarcillinae 0,3 mg di eparina per 10 ml di soluzione fisiologica sterile).
3. Preparare catetere tappi cannula. Tubo Tygon è tesa su un ago 23 gauge, e tagliare 1 cm dal smusso. Fondere l'estremità aperta del tubo per creare una tenuta spessa. Il tubo deve essere sciolto in modo che l'intero tappo cannula è abbastanza lungo per adattarsi sopra la cannula del catetere, con il raccordo terminale sigillato comodamente sul estremità della cannula. Si noti che se il tappo è troppo lungo, vi è il rischio che possa essere piegato e successivamente forata durante il processo di collegamento a vite sul catetere copre. Così accurata preparazione di tappi catetere è raccomandato, al fine di fornire una buona misura alla cannula.
4. Preparare le soluzioni richieste. Tutti i reagenti sono acquistati da Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, USA).
   1. Eparinizzato Ticarcillin soluzione per il lavaggio del catetere - Sciogliere 0,33 g Ticarcillin (sale disodico) e 0,003 g di eparina in 10 ml di soluzione salina sterile. 0,03 ml di soluzione viene lavata through il catetere quotidiana. La soluzione antibiotico viene somministrato per prevenire la formazione di coaguli di sangue e infezioni in via di sviluppo.
   2. Amikicin (antibiotico) per iniezione sottocutanea - Una singola iniezione sottocutanea viene dato dopo intervento chirurgico alla dose di 10 mg / kg per prevenire infezioni post-operatorie.
   3. Ketoprofene (analgesico) per iniezione sottocutanea - Una singola iniezione sottocutanea viene dato dopo intervento chirurgico alla dose di 5 mg / kg per gestire qualsiasi dolore post-operatorio.

4. Catetere impianto Chirurgia

Attrezzatura richiesta e reagenti: isoflurano, soluzione salina sterile, alcool (70%), 1 e 3 siringhe cc riempito con soluzione fisiologica sterile, 1-cc siringhe adeguate, soluzioni antibiotiche e analgesiche preparati al precedente punto 3, cateteri del mouse (CamCaths, Cambridgeshire, Regno Unito ), coperture catetere (tappi di cristallo di HRS scientifici, Montreal, Quebec), lubrificante occhio, 4 cm barra di plastica per elevare vena (questopuò essere costruito da un materiale plastico Q-tip), Polysporin, tamponi sterili e garze, pinze curve e rette, apposite pinze, forbici sottili.

1. Utilizzo di tecniche standard di asepsi in panchina chirurgico, gli strumenti chirurgici, i cateteri e sono sterilizzati prima dell'intervento. Tecniche di sterilizzazione in autoclave a vapore sono corrette per gli strumenti chirurgici, cateteri acquistati da CamCaths. Perle di vetro sterilizzazione può essere utilizzato anche sulle punte degli strumenti chirurgici. Sterilizzazione con ossido di etilene può essere impiegato su cateteri più delicati o materiali che fusione rischio. Una descrizione più dettagliata delle tecniche chirurgiche asettiche roditore può essere trovato nel ^1,2 allegata riferimenti. Impostazione del banco, strumenti e cono naso per l'anestesia di mantenimento è illustrato nella foto.
2. I topi sono anestetizzati con isoflurano gas, e mantenuti sotto anestesia mediante un tubo di respirazione in un sistema scavenging. Lubrificante oculare (Lacrime Naturale PM) viene applicato a entrambi gli occhi per evitare che si secchi durante la procedura. Un margine adeguato chirurgica è rasata sul dorso dell'animale e intorno al collo. Prima di qualsiasi incisioni sono fatte, i campi chirurgici sono limitati con teli sterili.
3. Al fine di preparare il catetere per l'inserimento nell'atrio destro del cuore, il tubo del catetere in eccesso viene tagliato 1,2 centimetri dal bulbo del catetere. Questa è la lunghezza ottimale stabilito per adulti topi CD-1, circa 8 settimane di età, 20-25 g di peso corporeo. La lunghezza del tubo di catetere può essere necessario modificare leggermente (per tentativi), in base alla dimensione ceppo, età e dei topi. Prima dell'inserimento, la siringa contenente soluzione salina sterile (sezione 3.2) è attaccato alla cannula del catetere e il catetere viene lavata e controllarne l'ermeticità. MantenereQuesta siringa collegata al catetere durante la procedura chirurgica. Esso verrà utilizzato per lavare il catetere, e aspiri sangue nel passo 4,7.
4. Dopo la sterilizzazione con il 70% di alcool, una lunga incisione cm 2 midscapular è realizzato a partire metà strada sul retro e termina appena sotto il collo per ospitare la base del catetere. Il tessuto connettivo deve essere staccata con una pinza per fare spazio per la base catetere sotto la pelle.
5. Posizionare l'animale sulla sua schiena, un poco profondo secondo 1-2 incisione cm diagonale è fatta dalla clavicola destra andando verso l'alto alla mascella gli animali, dopo che la zona è stata tamponata con il 70% di alcol. La vena giugulare sarà trovato superficialmente sotto la pelle del collo. In preparazione per l'inserimento del catetere, tubo dalla base del catetere viene tirato attraverso l'incisione sulla schiena e portato vicino alla vena giugulare passando il tubo sotto la pelle appena sopra la spalla destra. L'estremità del tubo del catetere èpoi collegato a un morsetto di arteria e posto a fianco dell'animale per tenerlo in posizione.
6. La vena giugulare destra si trova delicatamente allontanandosi connettivo superficiale e tessuto adiposo dalla incisione intorno al collo dell'animale. Il tessuto connettivo attorno alla vena è spezzato con pinze curve e la vena viene poi elevato utilizzando una barra di plastica sterile. Sciolti nodi di sutura sono aperte attorno ciascuna estremità della vena e il tubo del catetere viene infilato attraverso il nodo superiore e allacciata al filo di sutura di riposare sbloccaggio sulla spalla destra.
7. Prima dell'inserimento, bagnato sia l'inserimento dell'ago 20 gauge e vena con soluzione salina sterile per ridurre l'attrito. L'ago viene mantenuta parallela alla vena, e inserito dolcemente vicino al fondo della vena elevata (Nota: circa 0,5 cm della punta dell'ago deve inserire la vena). Utilizzando pinze, far scorrere il tubo del catetere giù l'albero dell'ago nella vena. Resistenza indicherebbe che il tubo is all'interno del tessuto connettivo e non all'interno della vena. Spingere 0,03 cc di soluzione fisiologica attraverso la vena per assicurarsi che non vi siano perdite. Perdite indicherebbe che la vena può essere forato o che il tubo di posizionamento del catetere deve essere regolato.
   Nota: Per verificare se il tubo è all'interno della vena, tentare di elaborare un po 'di sangue usando la siringa allegata salina. Se il sangue non può essere immediatamente redatto, la vena o parete cardiaca può occludere la punta del catetere, o la vena non è stato forato, regolare il tubo e riprovare. Ago reinserimento può essere necessario se il sangue non può ancora essere elaborati.
   
8. Al fine di fissare il catetere in posizione, premere il bulbo catetere al punto di inserimento e rimuovere l'ago. Legare il nodo fondo e poi tirare il filo catetere contro la barra prima di legare la seconda a destra nodo sopra la lampadina. Prova di nuovo per vedere se il sangue può essere redatto e sciogliere i nodi leggermente se necessario. Infilare il tubo del catetere sotto la pelle e sutural'incisione ventrale intorno al collo dell'animale. Applicare Polysporin Heal veloce utilizzando un cotton-fioc sterile, o di qualsiasi altra pomata antibiotica preferibilmente contenente un po 'di analgesico per l'incisione chiusa.
9. Con l'animale al addome, posizionare la base catetere sotto la pelle del dorso all'interno dell'incisione preparato. Assicurarsi che il tubo in eccesso viene minimamente in loop e ben nascosto sotto la base del catetere per ridurre al minimo le possibilità dell'animale masticazione e piercing. Suturare l'incisione su entrambi i lati della base catetere, e applicare rapidi Polysporin Heal utilizzando un applicatore con la punta di cotone sterile.
10. Lavare il catetere da 0,03 cc di soluzione di eparina ticarcillina utilizzando la siringa con il tubo fissata ad esso (sezione 3.2). Chiudere la cannula con il tappo in plastica e cannula vite sul coperchio della catetere bianco. In alcuni topi che sono freschi dalla chirurgia, il sangue può fuoriuscire del catetere prima della cannula è ridotta. È importante ripristinare lavare l'animale e rapidly tappare cannula prima di sangue ha la possibilità di defluire. Gli animali devono essere lavati ogni giorno per mantenere la pervietà del catetere.
11. Dopo aver pulito lungo la zona di iniezione tra gli animali gambe posteriori con 70% etanolo, sottocutanea iniettare il ketoprofene analgesico alla dose di 5 mg / kg su un lato, e l'antibiotico amikicin alla dose di 10 mg / kg sull'altro lato.
12. Dopo l'anestesia viene interrotto, gli animali sono autorizzati a recuperare in una gabbia pulita, con facile accesso a cibo e acqua per 5 a 7 giorni. Topi deve essere posto in un armadio riscaldato durante la notte per evitare ipotermia post-operatorio.

5. Test comportamentale - per via endovenosa Self-Amministrazione

1. Prima di cateteri di test comportamentali sono lavata con 0,9% di soluzione salina sterile. I topi sono quindi posizionared operante nelle camere e collegati alle linee di infusione e pompe di infusione. Presse a leva attivi comportare un secondo 3.2 18 microlitri infusione del farmaco accoppiato con l'illuminazione di una luce stimolo. Ogni pressa leva è seguito da un tempo di 8 sec out periodo durante il quale la luce stimolo rimane accesa.
2. Dopo la sessione operante, cateteri topi sono lavata con la soluzione eparinizzata ticarcillina prima di essere restituiti alla loro gabbia casa.
3. I topi sono autorizzati ad auto-somministrarsi per 3 ore consecutive 2-sessioni ad ogni dose. Le dosi sono stati presentati in un ordine casuale per ogni mouse, come mostrato nella sezione seguente.
4. Pervietà del catetere è valutata giornalmente assicurando che sia la soluzione salina e antibiotici può essere lavata attraverso il catetere. In aggiunta, un ketamina / midazolam prova può essere effettuata come descritto nel riferimento allegato ^5. In breve, i segni di anestesia come immobilità entro 5 secondi di una infusione di 0,02-0,03 ml ketamina (15 mg / ml),o midazolam (0,75 mg / ml), midazolam è la prova di un catetere brevetto ^5.

Representative Results

Figura 1. Il modello di risposta per la droga per via endovenosa di auto-somministrazione varia da droga, range di dosaggio e ceppo di topi impiegati. La figura mostra presentata cocaina auto-amministrazione i seguenti dati ambulatori catherization successo utilizzando la procedura descritta nel video. La figura mostra la media (± SEM) Infusioni di cocaina attivi e media (± SEM) il consumo di cocaina (mg / kg di peso corporeo) in una serie di 4 dosi di cocaina presentati in ordine casuale su un programma di rinforzo FR1. Ascissa: dose di auto-somministrato farmaco per infusione. A sinistra Ordinata: numero totale di infusioni conseguito durante il 2-ore di sessione operante. Destra Ordinata: l'assunzione di cocaina totale in mg / kg durante la 2 ore sessione di test. Tutti i cateteri 13 rimasti brevetto per la durata dello studio (4 settimane). Un one-way ANOVA condotta dalla dose rivelato che mice sono stati somministrazione di cocaina in modo dose-dipendente [F (1,12) = 42,8, p <0.05]. Vi è un aumento del consumo di cocaina sulla curva dose-risposta [F (3,36) = 29,6, p <0,05] nonostante una diminuzione leva d'alle dosi più alte. Ogni punto rappresenta la media di 3 sessioni di test per ciascuna dose di cocaina (± SEM) raccolti in topi CD-1 (n = 13 / dose, maschi e femmine insieme). Il confronto tra attivo (farmaco-rinforzato) leva vs inattivo rispondere in tutta la curva dose-risposta sono state effettuate utilizzando ANOVA a due vie per garantire che i topi sono stati discriminante tra le due leve. Per i topi CD1, l'analisi ha rivelato una preferenza per la leva attiva [F (1,12) = 10,255, p <0,05] sull'intera curva dose-risposta (dati non illustrati).

Discussion

Modelli animali di abuso di droga sono particolarmente utili per comprendere le basi genetiche della droga comportamenti. Per esempio, i topi con diversi profili genetici ereditabili mostrano differenze nella loro sensibilità alla cocaina ^6-8 e aiutare i candidati a identificare potenziali geni mediare la variabilità fenotipica osservata ^9. Le procedure di cateterizzazione endovenosa descritte in questo documento sono stati utilizzati con notevole successo di esaminare IVSA droga in vari ceppi di topi così come topi di differenti background genetico ^10.

Le procedure illustrate in questo video evidenziano fattori importanti su cui concentrarsi durante e dopo l'intervento chirurgico catherization per ottenere affidabili per via endovenosa di auto-amministrazione dei dati. Primo, il posizionamento del tubo del catetere entro l'atrio destro è vitale, per evitare guasti catetere di grumi blot. Durante l'intervento chirurgico è importante accertarsi che il catetereend è libero, e non occluso né dal cuore o tessuto vena. Secondo, lavaggio catetere giornaliera è necessaria sia prima che dopo le sessioni operante in modo da impedire il bloccaggio. Infine, la cannula del catetere deve essere coperta costantemente sia con la cannula tappi e cristallo copre quando gli animali sono nelle loro gabbie casa, per impedire l'ingresso di detriti. Blocco minore della cannula catetere può essere staccato con un bel 26 gauge, ma tutti i giorni lavaggio con la soluzione eparinizzata antibiotica è necessario, in particolare nei giorni in cui gli animali non sono testati per IVSA.

Per eseguire un intervento chirurgico la sopravvivenza degli animali, una buona conoscenza delle tecniche asettiche, analgesici e anestetici è necessario. Mentre il video non sostituisce corretta formazione chirurgica, può essere utilizzato come guida per i ricercatori che desiderano acquisire le tecniche necessarie per questo paradigma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ticarcillin Disodium Salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	1 gram bottle
Tears Naturale P.M (Eye lubricant)	Alcon	N/A	3.5 gram tube This eye lubricant can be found in most pharmacies. Any ophthalmic eye lubricant can be used.
Cocaine	Medisca Pharmaceutique	0723-06	1 gram bottle
Ketamine	Medisca Pharmaceutique	1754-04	25 gram bottle
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	1 gram bottle
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	250 gram bottle
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	1 gram bottle
Amikicin Sulphate salt	Sigma-Aldrich	A2324-5G	5 gram bottle
Sucrose ACS Reagent	Sigma-Aldrich	S5016-500G	500 gram bottle
Standard mouse catheters with soft mesh	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Tubing specifications: 26SWG;0.451;0.254
Crystal cap applicator	HRS Scientific	313CAC	This is the white catheter cap.
Tygon Micro Bore Tubing	Thomas Scientific	9561S41	Tubing specifications (bore x o.d. x wall thickness in inches): .01 x .03 x .01