在小鼠模型中静脉自我管理的方法

Summary

的静脉-的管理（IVSA）的范式被认为是研究在啮齿类动物中滥用药物的补强性的黄金标准。这手稿列出了实验步骤和手术技术必要获得可靠的IVSA的数据。特别突出，细致的导管植入术和维护。

Abstract

动物模型已经发展到学习的增强作用的药物，包括静脉-的管理（IVSA）范例。使用IVSA范式来研究药物如可卡因滥用的补强性的优点包括这样的事实，该药物是自我给药，而不是实验者给药，钢筋的时间表可以被改变，和精确的测量的数量药物以及消耗能够得到静脉注射液的定时和模式。此外，静脉给药，避免了首过代谢或味道有关的潜在的混淆，并产生血液和脑组织的药物浓度迅速增加。中列出此视频，静脉自我管理，恕不另行限食或药物训练前，小心导管放置在手术过程中和细致的日常导管冲洗和维护。在此列出实验程序本文包括动物住房和驯化方法的描述，使用甜牛奶解决方案的操作性培训，导管植入手术。

Protocol

1。动物房和驯化过程

1. 与同性窝，含有β的芯片的被褥和nestlet垫，线网格盖，以适应水的瓶子和食物标准的塑料笼，每笼5只，男性和女性都装CD-1小鼠。标准小鼠饲料和水在整个实验过程中的饲养笼可自由采食。
2. 维持小鼠的反向暗光的时间（灯在22:00至10:00）。
3. 允许小鼠使其恢复到IVSA检测室前一周的实验程序的开始。

2。操作性培训

1. 所有的行为程序，包括的甜牛奶培训和静脉注射毒品自我管理会话进行使用操作性室测量15.9×14×12.7厘米，配备超灵敏的鼠标杆，斗杯，刺激灯和微量注射泵（医学Associ阿泰，圣奥尔本斯，VT，USA）。钱伯斯是连接到一台计算机使用MED Associates的智能CR接口和地中海 - PC软件编程加固的时间表和收集数据。
2. 天真的小鼠熟悉的操作性室的培训，以杠杆压使用了瓢杯加糖的牛奶奖励（0.1毫升）。操作性牛奶培训5-7天进行1小时的会议。完成一个固定的比例（FR）的日程安排上的主动杆的北斗杯和刺激光照明的演示文稿中。甜牛奶溶液中加入全脂牛奶（脂肪含量3.25％），蔗糖（10毫克/毫升，ACS试剂，Sigma-Aldrich公司公司圣路易斯MO，USA）。操作性培训甜奶溶液或液体食品增强剂是一种常用的技术，用于以方便操作性响应在小鼠^1,2。

3。在手术过程中使用的设备的制备

热曲IRED设备 - 20，23和26号针，磨床，1毫升注射器，聚乙烯管，烙铁，肝素，抗生素和止痛剂。

1. 准备一个剃了20号针头的针引导到颈静脉插入导管。针的轴的剃下来使用研磨机，以形成一个通道内的针引导导管进入静脉。针通道应仔细检查，可能已沉积的金属碎片。任何障碍物的通道，应该用细尖钳刮出来。
2. 适应两个1-cc的注射器用于冲洗和检查导管。准备两个注射器Tygon管12厘米的片，并将其附加在其一端固定到1毫升注射器至26号针头，和拉伸管子的另一端，23号针头。一个注射器0.9％无菌生理盐水，其他应充满肝素化的的替卡西林解决方案（33毫克替卡西林和肝素每10毫升的无菌盐水中的0.3毫克）。
3. 准备导管插管的上限。聚乙烯管伸过来的23号针，切1厘米的斜面。熔体的管子的开口端，以创建一个厚的密封。应熔化的油管，从而使整个插管帽是足够长的，以适应在导管插管，紧贴在密封的端部装配件的套管的端部。请注意，如果帽太长，存在这样的风险，它将被弯曲并其后在过程中的安装螺钉导管覆盖穿孔。因此，精心准备的导管帽的建议，以提供一个适合的套管。
4. 准备好所需的解决方案。所有试剂购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯MO，USA）。
   1. 肝素化替卡西林导管冲洗溶液 - 溶解0.33克替卡西林（二钠盐）和0.003克的肝素在10ml的无菌生理盐水。 0.03毫升的溶液冲洗THRough每天导管。来自发展中国家的管理，以防止血液凝块和感染的抗生素溶液。
   2. amikicin（抗生素）用于皮下注射 - 单次皮下注射给予手术后的剂量为10毫克/公斤，以防止手术后感染。
   3. 酮洛芬（止痛药）皮下注射 - 单次皮下注射手术后的剂量为5毫克/公斤，以管理任何手术后的疼痛。

4。导管植入手术

所需的设备和试剂：异氟醚，无菌盐水，醇（70％），1和3毫升注射器填充用无菌生理盐水，1毫升，适于注射器，抗生素和镇痛的解决方案，在第3段中，鼠标的导管（CamCaths，剑桥，英国制备），导管盖（从的HRS科学，蒙特利尔，魁北克水晶帽），眼润滑剂，4厘米的塑料棒材，以提高静脉（这可以由一个塑料棉条），polysporin，无菌棉签，纱布，曲线和直线钳，动脉夹，精剪。

1. 使用标准的无菌操作技术，替补席上的手术，手术器械，导管手术前进行消毒。适当的消毒技术包括：蒸汽高压灭菌的手术器械和导管购自CamCaths。玻璃珠也可用于灭菌的外科器械上的提示。可以采用更细腻的导管或风险熔化的材料，环氧乙烷灭菌。啮齿动物手术的无菌技术的更详细的描述可以发现在所附的参考文献^1,2。设置的长椅上，仪器及维持麻醉的头锥的照片说明。
2. 小鼠麻醉与异氟醚气体，并保持在麻醉状态下清除系统下使用呼吸管。眼睛的润滑剂（泪自然漆PM）被施加到双眼，以防止它们在手术过程中干燥。适当的手术切缘剃了对动物的背部和绕在脖子上。在任何切口，外科领域限制使用无菌单。
3. 为了制备用于插入到导管的心脏的右心房，多余的导管被切断1.2厘米从灯泡的导管。这是最佳的长度建立成年CD-1小鼠，约8周龄，体重20-25克。导管管材的长度可能需要稍微调整（通过试验和错误）的基础上的应变，大小和年龄的小鼠。在插入之前，含有无菌生理盐水的注射器（第3.2节）被连接到导管插管，该导管被刷新，并检查是否有泄漏。保持在整个手术过程中，这种注射器连接到导管。它将被用于冲洗导管，并绘制在步骤4.7中的回血。
4. 用70％酒精消毒后，2厘米长的midscapular切口是在背面的中间开始和结束只是颈部以下的，以容纳在导管的基。结缔组织应该用钳子被迫分开，下面的皮肤的导管基地，以腾出空间。
5. 配售的动物在它的后面，第二个浅1 - 2厘米对角线切口是由右锁骨向上的动物下颚的区域已经被擦洗后，用70％的酒精。将被发现的颈静脉表面的皮肤下的颈部。在准备插入导管，导管的基础上从油管被拉通过切口的背面，并通过油管皮肤下，刚刚超过右肩靠近颈静脉带来。的导管的端部是然后连接到的动脉夹，并放置在动物的侧保持到位。
6. 右颈静脉位于通过轻轻移开浅表从动物的脖子上的切口周围的结缔组织和脂肪组织。静脉周围的结缔组织，用弯钳破碎和静脉，然后用消毒过的塑料棒升高。松散开放的缝合线结围绕静脉的每一端，并穿过导管顶端的结，和环绕在缝合线休息解除夹紧在右肩。
7. 在插入之前，湿的20个计插入针和静脉用无菌生理盐水，以减少摩擦。针保持平行到静脉，和插入的底部附近的升高的静脉（ 注：约0.5厘米的针尖需要输入静脉）轻轻。用镊子针轴，向下滑动导管插入静脉。电阻表明，管我s结缔组织之内，而不是在静脉内。通过静脉推0.03毫升生理盐水，以确保没有泄漏。泄漏会表明静脉可刺穿或导管的位置需要调整。
   注意：要检查管内静脉，试图制定一些血液，使用附带的盐水注射器。如果血液不能立即被制定，静脉或心脏壁可以阻断导管尖端，或没有被刺穿静脉;调整管，并再次尝试。针重新安置可能是必要的，如果血液中仍然不能被制定了。
   
8. 为了确保导管的位置，导管推灯泡插入点并取下针头。领带结底部，然后将导管冲洗第二个结绑在正上方的灯泡之前，对吧。再次测试，看是否可以得出血液和放松的结稍如果需要的话。塔克下导管的皮肤和缝合腹切口周围的动物的脖子上。应用Polysporin治愈快速使用无菌棉头涂药器，或任何其他抗生素软膏优选含有一定的镇痛到闭合切口。
9. 与动物在其腹部，放置导管基础的背部皮肤下内制备的切口。确保最低限度循环，隐藏在导管基地，以尽量减少动物的咀嚼和穿孔的机会，多余的管道。缝合切口两侧导管基地，并应用Polysporin效治疗快速用无菌棉棒敷贴。
10. 冲洗导管用0.03毫升的肝素替卡西林解决方案使用注射器管贴吧（3.2节）。盖上管与白色导管盖的塑料管帽和螺丝。在某些小鼠从手术是新鲜的，血液可能会泄漏的导管之前插管上限。重要的是要重新冲洗动物和rapidl的y替换插管帽前血的机会都流出来了。动物必须被刷新，每天都保持导管通畅。
11. 之间的动物后腿，用70％乙醇擦拭后的喷射区域，皮下注入镇痛酮洛芬一侧上为5毫克/公斤的剂量，并在剂量为10毫克/公斤的另一侧上的抗生素amikicin。
12. 麻醉后停止，动物可以恢复一个干净的笼子里，容易获得食物和水，5〜7天。小鼠被放置在一个恒温柜过夜，以防止手术后的低温。

5。行为测试 - 静脉自我管理

1. 在此之前的行为的测试导管的0.9％无菌生理盐水冲洗。然后将小鼠中的d操作性腔和连接到输液线和输液泵。活跃​​的杠杆印刷机导致一个3.2秒18μl反应药物输注加上刺激光照明。其次是由一个8秒的超时时间段，在此期间，刺激光停留在每一个杠杆压。
2. 继操作性会话，小鼠导管冲洗肝素替卡西林解决方案之前，回到自己的家乡笼。
3. 自我管理连续3个2小时的会议在各剂量组小鼠。剂量每只小鼠以随机的顺序，在下面的部分中所示。
4. 导管通畅每日评估确保生理盐水和抗生素的溶液通过导管可以被刷新。此外，氯胺酮/咪达唑仑测试如所附的参考文献⁵中描述的，可以进行。简言之，麻醉的迹象，如不动的5秒内的输液0.02-0.03毫升氯胺酮（15毫克/毫升），咪达唑仑（0.75毫克/毫升），咪达唑仑的专利导管^5的证据。

Representative Results

图1。响应静脉注射毒品的自我管理的模式会有所不同的药物，剂量范围内，小鼠品系采用。所提出的数字显示可卡因自我管理数据导管插入手术成功使用在视频中描述的步骤。图中显示的平均（±SEM）可卡因输液收入和平均（±SEM）可卡因消费量（毫克/公斤体重），在一系列的可卡因剂量以随机的顺序上FR1的加固进度。横坐标：自我管理的每次输注药物的剂量。左边的纵坐标总数：输液2小时操作性会议期间所赚取。右边的纵坐标：在2小时测试会话毫克/公斤的可卡因总量的摄入量。所有13个导管保持专利的研究的持续时间（4周）。一个单因素方差分析进行剂量透露，话筒e的管理可卡因的剂量依赖的方式[F（1,12）= 42.8，P <0.05]。在剂量反应曲线[F（3,36）= 29.6，P <0.05]，尽管减少了杆压在高剂量的可卡因消费在增加。每个数据点代表平均3测试会在每个的可卡因剂量（±SEM）收集的CD-1小鼠（N = 13 /剂量，男性和女性的结合）。使用2-way ANOVA分析，以确保两个杠杆之间的鉴别，小鼠的活性（药物增强）与非活动的杠杆响应跨越的剂量响应曲线的比较。对于CD1小鼠，分析揭示了偏好主动杆[F（1,12）= 10.255，p <0.05】在整个的剂量 - 反应曲线（未示出的数据在这里）。

Discussion

滥用药物的动物模型是特别有用的理解与毒品有关的行为的遗传基础。例如，小鼠与不同基因图谱显示，遗传差异在^6-8可卡因的敏感性，并帮助识别潜在的候选基因介导的表型变异观察^9。相当大的成功，静脉导管本文中所描述的程序已被用于检查药物IVSA在不同品系的小鼠以及不同遗传背景的小鼠^10。

这个视频中显示的程序，突出重要的因素集中在以下导管插入手术，以获得可靠的静脉自我管理数据。首先，导管在右心房的位置是至关重要的，为了防止导管失败印迹血栓。在手术过程中，它是重要的，以确保导管到底是畅通的，而不是闭塞的心脏或静脉组织。其次，需要每日导管冲洗操作性会话之前和之后，以防止堵塞。最后，导管插管，必须不断与插管帽和晶体涵盖当动物是在他们的家笼覆盖，以防止碎片的条目。罚款26号针头，但是每天肝素抗生素溶液冲洗是必需的，特别是当动物没有测试过IVSA的轻微堵塞的导管插管可能会脱落。

要执行，镇痛和麻醉的动物的生存手术，无菌操作技术，良好的知识是必要的。虽然这个视频不能取代适当的外科手术培训，它可以用来为指导，研究人员希望获得这个范例所必需的技术。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ticarcillin Disodium Salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	1 gram bottle
Tears Naturale P.M (Eye lubricant)	Alcon	N/A	3.5 gram tube This eye lubricant can be found in most pharmacies. Any ophthalmic eye lubricant can be used.
Cocaine	Medisca Pharmaceutique	0723-06	1 gram bottle
Ketamine	Medisca Pharmaceutique	1754-04	25 gram bottle
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	1 gram bottle
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	250 gram bottle
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	1 gram bottle
Amikicin Sulphate salt	Sigma-Aldrich	A2324-5G	5 gram bottle
Sucrose ACS Reagent	Sigma-Aldrich	S5016-500G	500 gram bottle
Standard mouse catheters with soft mesh	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Tubing specifications: 26SWG;0.451;0.254
Crystal cap applicator	HRS Scientific	313CAC	This is the white catheter cap.
Tygon Micro Bore Tubing	Thomas Scientific	9561S41	Tubing specifications (bore x o.d. x wall thickness in inches): .01 x .03 x .01