Los métodos para Autoadministración intravenosa en un modelo de ratón

Summary

La autoadministración intravenosa (IVSA) paradigma se considera el estándar de oro en el examen de las propiedades reforzantes de las drogas de abuso en los roedores. Este manuscrito describe los procedimientos experimentales y técnicas quirúrgicas necesarias para obtener datos fiables IVSA. En particular, la implantación del catéter meticulosa y mantenimiento están resaltados.

Abstract

Los modelos animales han sido desarrollados para estudiar los efectos de refuerzo de las drogas, incluyendo la autoadministración intravenosa (IVSA) paradigma. Las ventajas de utilizar un paradigma IVSA para estudiar las propiedades de refuerzo de las drogas de abuso tales como cocaína incluyen el hecho de que el fármaco es autoadministrado en lugar de experimentador-administrado, el programa de reforzamiento puede ser alterado, y la medición exacta de las cantidades de medicamentos consumidos, así como la temporización y el patrón de las inyecciones IV se pueden obtener. Además, la vía de administración intravenosa evita posibles confunde relacionados con el metabolismo de primer paso o sabor, y produce un rápido aumento en la sangre y niveles cerebrales de drogas. Como se indica en este vídeo, autoadministración intravenosa se puede conseguir sin la restricción de alimentos antes o después de la formación de drogas antes de la colocación del catéter cuidado durante la cirugía y el catéter diario meticuloso lavado y mantenimiento. Los procedimientos experimentales descritos en estapapel incluir una descripción de la estabulación y aclimatación métodos, la formación operante utilizando soluciones azucaradas leche, y la cirugía de implantación del catéter.

Protocol

1. Alojamiento de animales y Aclimatación Procedimientos

1. Masculino y femenino 1 CD-ratones se encuentran con personas del mismo sexo camada, hasta 5 animales por jaula, en jaulas de plástico estándar que contienen ropa de cama y las almohadillas de viruta beta nestlet, con tapas de rejilla de alambre para acomodar botellas de agua y alimentos. Estándar de comida para ratones y agua están disponibles ad libitum en las jaulas hogar durante todo el experimento.
2. Los ratones se mantuvieron en un reverso de luz-oscuridad calendario (luces encendidas 22:00-10:00).
3. Los ratones se les permite aclimatarse a los cuartos de prueba IVSA durante una semana antes del inicio de los procedimientos experimentales.

2. Formación operante

1. Todos los procedimientos conductuales que incluyen el entrenamiento leche azucarada y drogas por vía intravenosa sesiones de auto-administración se llevan a cabo utilizando cámaras operantes que miden 15,9 x 14 x 12,7 cm, equipada con 2 palancas ratón ultra-sensibles, tazas de balancín, luces de estímulo y bombas de jeringa de microlitro (Med Associates Inc., St. Albans, VT, EE.UU.). Cámaras están interconectados a un ordenador mediante Med Associates inteligente CR interfaz y software Med-PC para programar el horario de refuerzo y recopilación de datos.
2. Ratones no tratados están habituados a las cámaras operantes y entrenados para empujar la palanca con una recompensa de leche azucarada (0,1 ml) se presenta en una taza balancín. Formación leche operante se llevó a cabo en sesiones de 1 hora durante 5-7 días. Finalización de una proporción fija (FR) horario sobre la palanca activa como resultado la presentación de la taza de balancín y la iluminación de una luz de estímulo. La solución de leche endulzada consistía en sacarosa (10 mg / ml, reactivo ACS, Sigma-Aldrich Inc. St-Louis MO, EE.UU.) que se añade a la leche entera (3,25% de materia grasa). Entrenamiento operante con una solución de leche azucarada o un reforzador de alimentos líquidos es una técnica común utilizada para facilitar la respuesta operante en ^1,2 ratones.

3. Preparación del equipo que se utilizará durante la cirugía

Required equipo - 20, 23 y 26 agujas de calibre, amoladora, jeringas de 1 cc, tubo Tygon, soldador, heparina, antibióticos y analgésicos.

1. Preparar una aguja para guiar la inserción del catéter en la vena yugular de afeitar por abajo una aguja de calibre 20. El eje de la aguja se afeita abajo utilizando un molino para formar un canal dentro de la aguja para guiar la tubería del catéter en la vena. El canal de la aguja debe ser comprobado cuidadosamente para cualquier residuo de metal que pueden haber sido depositadas. Cualquier obstrucción en el canal debe ser raspado con pinzas de punta fina.
2. Adaptar dos 1-cc jeringas que se utilizan para el lavado y el control del catéter. Preparar dos jeringuillas mediante la adopción de piezas 12 cm de tubo de Tygon y adjuntarlos a un extremo de agujas de calibre 26 fijadas a jeringas de 1 cc, y el estiramiento de los otros extremos de la tubería sobre agujas de calibre 23. Una jeringa debe estar llena con 0,9% de solución salina estéril y el otro con una solución heparinizada ticarcilina (33 mg de ticarcilinay 0,3 mg de heparina por 10 ml de solución salina estéril).
3. Preparar catéter tapas cánula. Tubo de Tygon se estira sobre una aguja de calibre 23, y corte 1 cm del bisel. Fundir el extremo abierto del tubo para crear una junta de espesor. El tubo debe ser fundido de manera que toda la tapa de la cánula es suficientemente larga para ajustarse sobre la cánula del catéter, con el accesorio en el extremo sellado perfectamente sobre el extremo de la cánula. Tenga en cuenta que si la tapa es demasiado largo, existe el riesgo de que se doble y perforado posteriormente durante el proceso de acoplamiento de la rosca en la sonda cubre. Así, una preparación cuidadosa de las tapas del catéter se recomienda, con el fin de proporcionar un buen ajuste a la cánula.
4. Prepare las soluciones requeridas. Todos los reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, EE.UU.).
   1. Heparinizada solución Ticarcilina para el lavado del catéter - Disolver 0,33 g Ticarcilina (sal disódica) y 0,003 g de heparina en 10 ml de solución salina estéril. 0,03 ml de la solución se lava Through el catéter diaria. La solución de antibiótico se administra para prevenir la formación de coágulos de sangre e infecciones de vías de desarrollo.
   2. Amikicin (antibiótico) para la inyección subcutánea - Una sola inyección subcutánea se administra después de la cirugía en una dosis de 10 mg / kg para prevenir infecciones post-operatorias.
   3. Ketoprofeno (analgésico) para la inyección subcutánea - Una sola inyección subcutánea se administra después de la cirugía en una dosis de 5 mg / kg para controlar el dolor post-operatorio.

4. Catéter de la cirugía de implantación

Equipo necesario y reactivos: solución salina isoflurano, estéril, alcohol (70%), 1 y 3 jeringas cc llena con solución salina estéril, 1-cc jeringas adecuadas, soluciones de antibióticos y analgésicos preparados en el apartado 3 anterior, los catéteres de ratón (CamCaths, Cambridgeshire, Reino Unido ), tapas (tapas de cristal catéter de HRS Científicas, Montreal, Quebec), lubricante ocular, 4 cm de barras de plástico para elevar vena (estopuede ser construido de un plástico Q-tip), hisopos Polysporin, estériles y gasa, pinzas curvas y rectas, pinzas arteriales, tijeras finas.

1. Utilizando técnicas asépticas estándar del banco quirúrgica, los instrumentos quirúrgicos, y los catéteres son esterilizados antes de la cirugía. Técnicas adecuadas de esterilización incluyen vapor en autoclave para los instrumentos quirúrgicos y catéteres adquiridos de CamCaths. Cuenta de vidrio esterilización también se puede utilizar en las puntas de los instrumentos quirúrgicos. La esterilización con óxido de etileno se pueden emplear en catéteres más delicados o materiales que fusión riesgo. Una descripción más detallada de las técnicas quirúrgicas asépticas roedores se puede encontrar en el ^1,2 referencias adjunta. Puesta en marcha de la banca, los instrumentos y el cono de la nariz mantenimiento de la anestesia se ilustra en la foto.
2. Los ratones se anestesian con gas isoflurano, y mantenido bajo anestesia utilizando un tubo de respiración en un sistema de recolección de residuos. Lubricantes para los ojos (Tears Naturale PM) se aplica a ambos ojos para evitar que se seque durante el procedimiento. Un margen quirúrgico adecuado se afeita sobre el lomo del animal y alrededor del cuello. Antes de que las incisiones se hacen, los campos quirúrgicos se limitan con paños estériles.
3. Con el fin de preparar el catéter para la inserción en la aurícula derecha del corazón, el tubo del catéter se corta el exceso de 1,2 cm desde el bulbo del catéter. Esta es la longitud óptima establecido para adultos ratones CD-1, aproximadamente 8 semanas de edad, 20-25 gramos de peso corporal. La longitud del tubo de catéter puede ser necesario ajustar ligeramente (por ensayo y error), basada en la cepa, tamaño y edad de los ratones. Antes de la inserción, la jeringa que contiene solución salina estéril (sección 3,2) está unido a la cánula del catéter, y el catéter se vacía y fugas. Manteneresta jeringa unida al catéter durante el procedimiento quirúrgico. Será utilizado para lavar el catéter y retirar la sangre en el paso 4.7.
4. Después de la esterilización con alcohol al 70%, un 2 cm medioescapular larga incisión se hace a partir a mitad de camino en la parte posterior y que termina justo debajo del cuello con el fin de acomodar la base del catéter. El tejido conectivo se debe forzar aparte con pinzas para hacer espacio para la base de catéter debajo de la piel.
5. Colocar al animal en su parte posterior, un segundo superficial 1 a 2 cm diagonal incisión se hace de la clavícula derecha que va hacia arriba a la mandíbula animales, después de que el área ha sido limpiado con alcohol al 70%. La vena yugular se encuentra superficialmente bajo la piel del cuello. En la preparación para la inserción del catéter, el tubo de la base de que el catéter se extrae a través de la incisión en la parte posterior y llevado cerca de la vena yugular haciendo pasar el tubo bajo la piel justo por encima del hombro derecho. El extremo del tubo de catéter estádespués se une a una abrazadera de la arteria y se coloca en el costado del animal para mantenerlo en su lugar.
6. La vena yugular derecha se encuentra moviendo suavemente lejos conjuntivo superficial y el tejido adiposo de la incisión alrededor del cuello del animal. El tejido conjuntivo alrededor de la vena se rompe aparte utilizando pinzas curvas y la vena se eleva mediante una barra de plástico estéril. Sueltas nudos de sutura abiertos se realizan alrededor de cada extremo de la vena y el tubo de catéter se inserta a través del nudo superior y colocado sobre el hilo de sutura para descansar sin sujeción sobre el hombro derecho.
7. Antes de la inserción, mojado tanto la inserción de la aguja de calibre 20 y la vena con solución salina estéril para reducir la fricción. La aguja se mantiene paralela a la vena, y se inserta suavemente en la parte inferior de la vena elevada (Nota: aproximadamente 0,5 cm de la punta de la aguja tiene que entrar en la vena). Utilizando pinzas, deslice el tubo del catéter hacia abajo del eje de la aguja en la vena. Resistencia indicaría que el tubo is en el tejido conectivo y no dentro de la vena. Empuje 0,03 cc de solución salina a través de la vena para asegurarse de que no hay fugas. Fugas indicaría que la vena puede ser perforado o que el tubo de catéter de colocación necesita ajuste.
   Nota: Para comprobar si el tubo está dentro de la vena, pretender elaborar un poco de sangre con la jeringa de solución salina adjunto. Si la sangre no puede ser inmediatamente establecido, la vena o pared del corazón se pueden ocluir la punta del catéter, o la vena no se ha perforado, ajuste el tubo y vuelva a intentarlo. Aguja reinserción puede ser necesaria si la sangre todavía no se puede elaborar.
   
8. Con el fin de asegurar el catéter en su lugar, empuje la bombilla catéter hasta el punto de inserción y retire la aguja. Atar el nudo inferior y tire del catéter al ras contra la barra antes de atar el nudo justo por encima de la segunda bombilla. Pruebe de nuevo para ver si la sangre puede ser elaborado y aflojar los nudos ligeramente si es necesario. Doble el tubo del catéter bajo la piel y suturala incisión ventral alrededor del cuello del animal. Aplicar Polysporin Heal rápida utilizando un aplicador de punta de algodón estéril, o cualquier otro ungüento antibiótico que contiene preferiblemente algún analgésico a la incisión cerrada.
9. Con el animal en su abdomen, coloque la base del catéter debajo de la piel de la parte posterior dentro de la incisión preparada. Asegúrese de que el exceso de tubo está mínimamente bucle y bien escondido debajo de la base del catéter para reducir al mínimo las posibilidades de que el animal mastica y perforándolo. Suturar la incisión en ambos lados de la base del catéter, y aplicar Fast Heal Polysporin usando un aplicador de punta de algodón estéril.
10. Enjuague el catéter con 0,03 cc de la solución heparinizada ticarcilina con la jeringa con el tubo fijado a la misma (sección 3.2). Tape la cánula con la tapa de plástico cánula y el tornillo de la tapa del catéter blanco. En algunos ratones que son frescos de la cirugía, la sangre puede salir del catéter antes de la cánula tiene un tope. Es importante volver a lavar el animal y rapidly coloque la tapa ante cánula arterial tiene la oportunidad de fluir hacia fuera. Los animales deben lavarse a diario para mantener la permeabilidad del catéter.
11. Después de limpiar abajo de la zona de inyección entre los animales patas traseras con 70% de etanol, por vía subcutánea inyectar el analgésico ketoprofeno en una dosis de 5 mg / kg en un lado, y la amikicin antibiótico a una dosis de 10 mg / kg en el otro lado.
12. Después de la anestesia se interrumpe, los animales se les permitió recuperarse en una jaula limpia con fácil acceso a comida y agua durante 5 a 7 días. Los ratones se deben colocar en un armario caliente durante la noche para evitar la hipotermia postoperatoria.

5. Comportamiento de prueba - autoadministración intravenosa

1. Antes de catéteres de las pruebas de comportamiento se lavan con un 0,9% de solución salina estéril. Los ratones son luego colocard en las cámaras operantes y conectado a las líneas de infusión y bombas de infusión. Prensas activos palanca resultar en un 3,2 seg 18 de infusión de fármaco l junto con la iluminación de una luz de estímulo. Cada vez que presione la palanca es seguido por un tiempo de 8 segundos a cabo período durante el cual el estímulo de luz permanece encendida.
2. Después de la sesión operante, catéteres ratones se enjuagan con la solución heparinizada ticarcilina antes de ser devuelto a su jaula.
3. Los ratones se les permite auto-administrarse por 3 consecutivos 2-hr sesiones en cada dosis. Las dosis se presentan en un orden aleatorio para cada ratón, como se muestra en la siguiente sección.
4. La permeabilidad del catéter se evaluó diariamente por asegurar que tanto la solución salina y el antibiótico puede ser lavado a través del catéter. Además, una prueba de ketamina / midazolam puede llevarse a cabo como se describe en la referencia adjunta ^5. En breve, los signos de anestesia, tales como la inmovilidad dentro de 5 segundos de una infusión de 0.02-0.03 ml de ketamina (15 mg / ml),o midazolam (0,75 mg / ml) midazolam es evidencia de un catéter de patente ^5.

Representative Results

Figura 1. El patrón de respuesta de drogas por vía intravenosa auto-administración variará por rango de dosis de fármaco, y la cepa de ratón empleada. La figura presenta muestra de auto-administración de cocaína datos después de cirugía cateterismo con éxito utilizando el procedimiento descrito en el vídeo. La figura muestra la media (± SEM) de cocaína infusiones ganado y la media (± SEM) el consumo de cocaína (mg / kg de peso corporal) a través de una serie de 4 dosis de cocaína que se presentan en un orden aleatorio en un horario FR1 de refuerzo. Abscisa: dosis de auto-administrado fármaco por infusión. Izquierda Ordenadas: número total de infusiones obtenidas durante la sesión de 2 horas operante. Derecho Ordenadas: consumo total de cocaína en mg / kg durante la sesión de prueba de 2 horas. Todos los 13 catéteres se mantuvo patente para la duración del estudio (4 semanas). Un ANOVA de una vía a cabo en dosis reveló que mice administraban cocaína de una manera dependiente de la dosis [F (1,12) = 42.8, p <0,05]. Hay un aumento en el consumo de cocaína sobre la curva dosis-respuesta [F (3,36) = 29.6, p <0,05] a pesar de una disminución de la palanca de presión a las dosis más altas. Cada punto de datos representa la media de 3 sesiones de evaluación en cada dosis de cocaína (± SEM) recogidos en ratones CD-1 (n = 13 / dosis, hombres y mujeres combinados). Las comparaciones de activo (fármaco reforzado) vs palanca inactiva la respuesta a través de la curva de respuesta a la dosis se realizaron mediante ANOVA de dos vías para asegurar que los ratones estaban discriminando entre las dos palancas. Para los ratones CD1, el análisis reveló una preferencia por la palanca activa [F (1,12) = 10,255, p <0,05] sobre toda la curva dosis-respuesta (datos no presentados aquí).

Discussion

Los modelos animales de abuso de drogas son particularmente útiles en la comprensión de la base genética de la droga comportamientos relacionados. Por ejemplo, los ratones con diferentes perfiles genéticos hereditarios muestran diferencias en su sensibilidad a la cocaína ^6-8 y ayudar a identificar los posibles genes candidatos mediación de la variabilidad fenotípica observada ^9. Los procedimientos de cateterización intravenosa descritos en este documento se han utilizado con éxito considerable para examinar IVSA drogas en varias cepas de ratones, así como los ratones de diferentes orígenes genéticos ^10.

Los procedimientos que se muestran en este vídeo resaltar factores importantes para centrarse durante y después de la cirugía de cateterización para obtener fiables intravenosas de auto-administración de datos. En primer lugar, la colocación de la tubería del catéter dentro de la aurícula derecha es vital, con el fin de evitar fallos en el catéter de coágulos de sangre. Durante la cirugía, es importante asegurarse de que el catéterfinal no está obstruido, y no ocluido por el corazón o el tejido venoso. En segundo lugar, el lavado del catéter diaria es necesaria antes y después de las sesiones operantes con el fin de evitar obstrucciones. Finalmente, la cánula de catéter debe ser constantemente cubierto tanto con la cánula y las tapas de cristal cubre cuando los animales están en sus jaulas de origen, para evitar la entrada de residuos. Minor bloqueo de la cánula del catéter puede ser desplazado utilizando una aguja de calibre fino 26, sin embargo diaria de lavado con la solución de antibióticos heparinizada se requiere, especialmente en días cuando los animales no se someten a prueba para IVSA.

Para llevar a cabo la cirugía de supervivencia de los animales, un buen conocimiento de las técnicas de asepsia, analgesia y anestesia es necesaria. Mientras que este vídeo no sustituye a la formación quirúrgica apropiada, puede ser utilizado como una guía para los investigadores que desean adquirir las técnicas necesarias para este paradigma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ticarcillin Disodium Salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	1 gram bottle
Tears Naturale P.M (Eye lubricant)	Alcon	N/A	3.5 gram tube This eye lubricant can be found in most pharmacies. Any ophthalmic eye lubricant can be used.
Cocaine	Medisca Pharmaceutique	0723-06	1 gram bottle
Ketamine	Medisca Pharmaceutique	1754-04	25 gram bottle
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	1 gram bottle
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	250 gram bottle
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	1 gram bottle
Amikicin Sulphate salt	Sigma-Aldrich	A2324-5G	5 gram bottle
Sucrose ACS Reagent	Sigma-Aldrich	S5016-500G	500 gram bottle
Standard mouse catheters with soft mesh	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Tubing specifications: 26SWG;0.451;0.254
Crystal cap applicator	HRS Scientific	313CAC	This is the white catheter cap.
Tygon Micro Bore Tubing	Thomas Scientific	9561S41	Tubing specifications (bore x o.d. x wall thickness in inches): .01 x .03 x .01