Summary
For nylig high-throughput sekventering teknologi har i høj grad øget følsomhed af kromatin Immunpræcipitation (CHIP) eksperiment, og bedt sin ansøgning ved hjælp af oprensede celler eller dissekeret væv. Her har vi skitsere en metode til at bruge CHIP teknik med
Abstract
Epigenetik er fortsat en rivende udvikling felt, der undersøger, hvordan kromatin staten bidrager til differentiel genekspression i forskellige celletyper på forskellige udviklingsstadier. Epigenetisk regulering bidrager til et bredt spektrum af biologiske processer, herunder celledifferentiering under embryonisk udvikling og homeostase i voksenalderen. En kritisk strategi i epigenetiske studier er at undersøge, hvordan forskellige histon modifikationer og kromatin faktorer regulerer genekspression. For at løse dette, er kromatin Immunpræcipitation (CHIP) anvendes bredt for at få et øjebliksbillede af sammenslutningen af bestemte faktorer med DNA i cellerne af interesse.
CHIP teknik almindeligvis bruger dyrkede celler som udgangsmateriale, som kan fås i overflod og homogenitet til at generere reproducerbare data. Der er imidlertid adskillige forbehold: første miljø til at dyrke celler i petriskålen er forskellig fra den in vivo, kan såledesikke afspejle den endogene kromatin tilstand af celler i en levende organisme. Sekund, kan ikke alle typer af celler skal dyrkes ex vivo. Der er kun et begrænset antal cellelinier, som folk kan opnå tilstrækkeligt materiale til CHIP assay.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til at gøre CHIP forsøg under anvendelse af Drosophila væv. Udgangsmaterialet dissekerede væv fra et levende dyr, kan således præcist afspejler det endogene kromatin tilstand. Tilpasningsevne denne metode med mange forskellige typer af væv vil give forskere til at løse en masse mere biologisk relevante spørgsmål vedrørende epigenetisk regulering in vivo 1, 2. Kombinere denne fremgangsmåde med højt gennemløb sekventering (Chip-seq) vil yderligere give forskere til at opnå en epigenomic landskab.
Protocol
(Hele chippen Proceduren tager cirka to dage. Udarbejdelse af chip biblioteker for high-throughput sekventering tager yderligere 2-3 dage.)
1. Dissekere og Forbered væv til CHIP Experiment (~ 1 million celler)
- Dissekere væv af interesse (f.eks 200 par af Drosophila testikler) i koldt PBS + 1x proteaseinhibitor (opløse en pellet af proteaseinhibitor-cocktail i 1,5 ml 1X PBS til opnåelse 7x stamopløsning) + PMSF (slutkoncentration 100 ug / ml). Skylles væv to gange og resuspenderes væv i 200 pi af den samme PBS-opløsning med inhibitorer.
- Du kan løse prøven, tilsættes 5,5 pi 37% formaldehyd (varm formaldehyd i 37 ° C vandbad i 1 minut, før du bruger). Inkuber ved 37 ° C i 15 minutter, hvirveldannende hvert 5. minut i mellem.
- Placere prøven på is vævet til bundfældning i 2 minutter. Skylles 2 gange med 450 pi PBS (med protease-inhibitorer og PMSF). Prøven kan nu butikkend ved -20 ° C. Gentag dissektion flere gange for at få nok materiale til CHIP.
2. Forbered Supernatant med Protein-DNA Konjugation for CHIP Assay
- Kombiner nok prøve fra trin 1,3 i 1,75 ml eppendorfrør.
- Fjerne PBS fra vævsprøve. Tilsæt 200 pi lysisbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,6, 1 mM CaCl2, 0,2% Triton X-100 eller NP-40, 5 mM butyrat, og 1x proteinaseinhibitor cocktail). Tilsættes frisk PMSF stamopløsning lysisbuffer (PMSF slutkoncentration på 0,5 mM). Homogenisere med blå homogenisator (Fisher Cat # 749.521-1590), indtil vævene dissociere helt uden nogen aggregering, inkuberes ved stuetemperatur (stuetemperatur) i 10 minutter.
- Sonikering: brug microtip sonikator (Misonix HS-XL200) ved magt 20. Ultralydsbad i 10 sekunder og hvile på is til 50 sek. Gentag 4-5 gange (optimal sonikering tid skal bestemmes empirisk, da længere sonikering vil give mindre fragmenter. For chip under anvendelse af antistoffer mod Histone ændringer, vi normalt lydbehandling kromatin til ca 200-300 bp, for transskriptionsfaktor eller kromatin regulator (f.eks Polycomb proteiner), vi normalt lydbehandling kromatin til 200-1000 bp. Imidlertid bør det optimale fragmentstørrelse testes empirisk. Bemærk: HOLD ALTID røret på ICE Selv under sonikerende at undgå prøveoverførsel fra opvarmning UP!
- Fortyndes prøven ved tilsætning af 1,8 ml RIPA-puffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% Na-deoxycholat, 1% Triton X-100, med protease-inhibitorer og PMSF ved den samme koncentration som beskrevet tidligere). Spare 40 uL som indgangssignal ved tilsætning af 2 ul 5 M NaCl og inkuberes ved 65 ° C natten over (O / N) for at vende tværbinding.
- At konjugere antistoffet til perler, der tilsættes 40 uL Protein A-perler til et 1,5 ml Eppendorf-rør, hvorefter der tilsættes 600 pi PBS og sten ved 4 ° C i 2 minutter, anvendes perlerne magnet og fjerne supernatanten. Tilsæt 100 pi PBS og antistoffet af interesse (mængden af antistof skal bestemmes empirmæssigt). Inkuber ved stuetemperatur i 1 time eller 4 ° C i 4 timer.
- Fjerne supernatanten fra perlerne ved magnet, og der tilsættes 1 ml chromatin ekstrakt fra trin 2.4, til perlerne. Roterer ved 4 ° CO / N.
- Anvendelse fritteprøve at magneten og fjerne supernatanten. Vask af perlerne med den følgende buffer ved 4 ° C i 10 minutter:
2x med 1 ml RIPA-puffer [1,89 mL 'RIPA-buffer' + 315 gl 7x proteaseinhibitorer + 20 uL PMSF];
2x med 1 ml RIPA-puffer + 0,3 M NaCI [1,89 ml RIPA-puffer + 220 pi 3 M NaCI];
2x med 1 ml LiCI puffer (0,25 M LiCI, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC);
1x med 1 ml 1x TE + 0,2% Triton X-100;
1x med 1 ml 1x TE. - For at vende tværbinding, resuspenderes perlerne i 100 pi TE-buffer + 3 uL 10% SDS + 5 pi proteinase K (20 mg / ml). Inkuber ved 65 ° CO / N.
- Anvendelse perlerne magnet og overføre supernatanten til et nyt rør. Supernatanten indeholder din DNA-prøve. Vaskes perlerne med 100 pi TE + 0,5 MNaCl og kombinere de to supernatanten.
- Phenol-chloroform ekstraktion af DNA-prøven. Tilsæt 200 uL Phenol: Chlorofrom: IAA (25:24:1) mix og vortex. Rotere med 14k i 5 minutter ved RT. Alternativt kan DNA ekstraheres ved hjælp af Qiagen PCR Purification Kit.
- Supernatanten overføres / vandige lag til et nyt rør, og der tilsættes lineær acrylamid til en slutkoncentration på 20 ug / ml (alternativt en pi glycogen ved 20 mg / ml for hver 1 ml supernatant, kan også anvendes. Glycogen anvendes til efterfølgende qPCR eller PCR-analyser mens lineær acrylamid anvendes til sekventering assays.) Tilsæt 20 pi 3M NaOAc og 500 pi 100% EtOH. Bland godt og inkuber ved 80 ° C i 10 minutter. Centrifugering ved maksimal hastighed i 20 minutter ved 4 ° C.
- Fjerne supernatanten og vask med 300 pi 70% EtOH. Lufttørres og resuspender prøven i 50 pi TE-buffer. Prøven kan nu opbevares ved -20 ° C. Prøven kan anvendes til kvantitativ PCR (qPCR) assay (figur 1).
3a. Analysere Chip-ed-DNA under anvendelse qPCR
- Fortynd genomisk DNA ved følgende koncentrationer til at foretage en standardkurve: ufortyndet, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.
- For hvert primerpar, nedsat qPCR in duplo i en 96-brønds plade med genomisk DNA fra trin 3A.1, input kontrol chip-ed DNA:
10 uL 2x SYBR PCR-blanding (Fermentas, K0222);
1 pi 10 uM fremadrettet primer;
1 pi 10 uM revers primer;
X uL Chip-ed DNA (indgangs kontrol, eller genomisk DNA);
y uL nuklease uden H2O at justere reaktionsvolumen på 20 ul. - Vågeblus 96-brønds plade med Mini plade spinner (LABNET).
- Udfør qPCR med ABI 7300 real-time PCR-system (eller andre real-time PCR systemer) ved hjælp af følgende betingelse:
Trin 1: 50 ° C i 2 minutter, 1 cyklus;
Trin 2: 95 ° C i 10 minutter, 1 cyklus;
Trin 3: 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 minut, 40 ° Cycles;
Trin 4 (dissociation trin): 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 minut, 95 ° C i 15 sek. - Kontroller dissociationskurven: en top ved termisk dissociation plottet viser en enkelt amplikon fra PCR-reaktionen. Mere end én top viser ikke-specifik produkt med primerparret bør qPCR data ikke anvendes.
- Bestemme den lineære fase af eksponentiel amplifikation af PCR-reaktionen for hver primersæt, ved at beregne den formel, der løser DNA mængde ifølge Ct (cyklus tærskelværdi) værdi, som er baseret på standardkurven under anvendelse af serien af fortyndet genomisk DNA i 3a. 1.
- Hvis Ct værdien af chip-ed DNA og indgangssignal er inden for det lineære område af Ct værdi beregnes berigelsen af chip-ed DNA versus indlæsningssignalets ifølge fortynding faktor Chip-ed-DNA og input kontrol 2,4.
3b. Forstærk Chip-ed DNA til high throughput sekventering.
- End-reparation af Chip-ed DNA mix (BrugEpicentret DNA END-Repair kit), der blev oprettet på is:
1-34 pi genomisk DNA fra trin 2,12 (0,1 til 5 ug)
5 ul 10 x End reparation puffer
5 ul 2,5 mM dNTP-blanding
5 ul 10 mM ATP
x pi H2O at justere reaktionsvolumenet 49 pi
1 pi End-Repair Enzyme blanding (T4 DNA-polymerase + T4 polynukleotidkinase)
Inkuber i 45 minutter ved RT. Rense reaktionen under anvendelse af Qiagen MinElute Reaktion
Oprydning kit. Eluering med 30 ul elueringsbuffer (EB). - Tilsættes A-overhæng til 3'-enden:
30 ul eluerede DNA-produkt fra trin 3B.1
5 ul 10 x NEB-puffer nr. 2
10 pi 1 mM dATP
2 pi dH2O
3 gl 5 U / ul Klenow-fragment (3 '→ 5' exo-)
Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C. Oprense reaktion under anvendelse MinElute ReactionCleanup kit. Eluering med 10 pi EB. - Solexa linker-ligering:
10 ul eluerede DNA fra trin 3B.2
10 pi ddH2O
2,5 μ l 10x T4 DNA ligasepuffer
1 gl Adaptor oligo mix fra Illumina (1/10-diluted fra lager)
2,5 gl T4 DNA ligase (400 enheder / ul)
Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Oprense reaktion under anvendelse MinElute ReactionCleanup kit. Eluering med 20 ul EB. Prøven kan nu opbevares ved -20 ° C. - Køre eluerede DNA-prøve fra trin 3B.3 hjælp af E-gelapparat. Isoler 300-500 bp bånd i gelen og renses under anvendelse af Qiagen Gel Extraction Kit (dette trin eliminerer de ~ 125 bp selvligeret linkere fra adapteren oligo ligering). Eluering med 12 pi EB.
- Forstærk Library ved hjælp af parret udgang (PE) primere fra Illumina:
10,5 pi eluerede DNA fra trin 3B.4
12,5 gl mester mix (2X Phusion HF, Finnzymes)
1 ml af PE1 PCR-primer 1
1 ml af PE2 PCR-primer 2
PCR betingelse:
98 ° C i 30 sek
(98 ° C 10 sek, 65 ° C 30 sek, 72 ° C 30 sek), gentages 20 cyklusser
72 ° C i 5 minutter. - Prøver fra trin 3B.5 kan anvendes til Chip-seq efter valg af den passende størrelse DNA (300-500 bp) ved anvendelse af standard 2% agarosegel. Prøven kan nu opbevares ved -20 ° C. Det er bedst at isolere hver chip prøve på en enkelt gel for at forhindre kontaminering. Prøver kan sendes til high-throughput sekventering.
3c. Solexa pipeline-analyse
- Den 25-bp-sekventering læser blev opnået fra Illumina Genome Analyzer (GA) rørledningen.
- Alle hits blev tilpasset til Drosophila genomet (dm3) ved hjælp af Eland (effektiv lokal Justering af Nukleotid Data) software, der tillader op til to fejlparringer med reference sekvens.
- Unikt kortlagt læst blev godkendt til nedstrøms analyse. For multiple identiske læst, blev op til tre kopier bibeholdt for at reducere muligheden for forspænder fra PCR-amplifikation.
- Udgangen af GA Pipeline blev omdannet til browser strækbare data (seng) filer.
- For at generereparykken filer til overførsel til UCSC browseren for visualisering, anvendte vi en python skrifterne, der er beskrevet i en tidligere publikation 3 med 4 bp som vinduets størrelse og 160 bp som DNA-fragmentstørrelse.
- At klassificere Drosophila gener i tavse og udtrykte gener, brugte vi en digital kaldte nummer RPKM (læser / pr kilobaser fusioneret exonic region / per million tilknyttede læser). Gener med RPKM = 0 blev klassificeret som tavs gruppe, og gener med RPKM ≥ 1 blev klassificeret i de udtrykte grupper, som kan inddeles i tre undergrupper gener med lav, moderat og høj ekspressionsniveauer, og hver gruppe har omtrent samme antal gener.
- At sammenligne histon ændring niveau og genekspression, brugte vi et Python-script, der er blevet beskrevet i en tidligere publikation 3.
4. Repræsentative resultater
Eksempler på Chip-qPCR resultater ved anvendelse af BAM (pose kugler) mutant testikler er vist i figur 1 4. I Bam testikler, er der en fejl i overgangen fra proliferative spermatogonier at differentiere spermatocytter 5, 6. Vi anvender BAM testes som en kilde for udifferentierede kimceller, der er beriget i dette væv type. Differentiering gener nødvendige for sperma differentiering, såsom han-specifik transkriptionsfaktor 87 (mst87F), Don Juan (dj) og fuzzy løg (fzo) ikke udtrykkes i Bam testikler. Disse gener er stærkt beriget med det undertrykkende H3K27me3 histon modifikation 7 (fig. 1A), men er fri for den aktive H3K4me3 histon modifikation 8 (figur 1B), en kromatin signatur vi kaldte "monovalent" 7. Berigelse af enten H3K27me3 eller H3K4me3 bestemmes ved normalisering til et konstitutivt udtrykt cyclin A (CycA) genet 4.
Indholdet "> Chip-seq analyse under anvendelse af det samme sæt af antistoffer (dvs. undertrykkende H3K27me3 og aktive H3K4me3) med Bam mutante testikler (fig. 2) valideret qPCR resultaterne vist i figur 1. For de tre testede terminal differentiering gener mst87F, dj og fzo , deres genomiske regioner særdeles beriget med H3K27me3 men ikke H3K4me3 (figur 2A-2C). I modsætning hertil har det konstitutivt udtrykte CycA genet signifikant H3K4me3 men lidt H3K27me3 binding nær dets transkriptionsstartstedet (TSS) (figur 2D).Endvidere, chippen profiler H3K27me3 og H3K4me3 nær TSSs fire klasser af differentielt udtrykte gener er i overensstemmelse med funktionen af hver histon modifikation. Som vist i figur 3A, er tilsætning af H3K27me3 nedstrøms for TSSs omvendt korreleret med genekspression niveau. De tavse gener har den højeste H3K27me3 menshøjt udtrykte gener har nogen H3K27me3 binding. Disse data er i overensstemmelse med den undertrykkende rolle H3K27me3 på genekspression. I modsætning hertil viste berigelse af H3K4me3 omkring TSSs modsat korrelation med genekspressionsniveau (figur 3B), i overensstemmelse med den aktive rolle H3K4me3 på genekspression.
Figur 1. QPCR analyse af chip-ed-DNA under anvendelse af antistof mod enten det undertrykkende H3K27me3 histon modifikation (A) eller aktiv H3K4me3 histon modifikation (B) i udifferentierede celle-berigede BAM mutante testikler. (A) i Bam testikler, differentiering gener (Mst87F, DJ, fzo) er beriget med H3K27me3 undertrykkende histon modifikation. (B) differentiering gener er udtømt med H3K4me3 aktiv mærke. Niveauet af Chip DNA (CHIP DNA / input) på målgenet (Mst87F, DJ eller fzo) blev først normaliseret til lev el af CHIP DNA ved kontrollen CycA genet. Fejlsøjler angiver standard afvigelse fra tre uafhængige biologiske gentagelser.
Figur 2. UCSC genom browser snapshots af H3K27me3 og H3K4me3 berigelse på tværs af hele genomiske regioner (A) Mst87F (B) dj og (C) fzo og (D) CycA gener. Cirkel H3K27me3-beriget region i (D) afspejler kromatin status en overlappende gen CG7264, som er ringe udtrykkes i Bam testikler (RPKM = 1), men stærkt udtrykt i vildtype-testikler (RPKM = 130) 8 (Chip-seq data 7). Prober anvendt i kvantitativ PCR-analyse af chip Resultaterne i figur 1 er forsynet ved bunden af hver plot. se større figur .
tp_upload/3745/3745fig3.jpg "/>
Figur 3. Chip-seq profiler under anvendelse H3K27me3 og H3K4me3 i Bam testikler 7. De fire gen-grupper (7,509 gener) blev klassificeret i henhold til deres genekspression niveauer baseret på RNA-seq resultater 8. De repræsentative klasser af gener er afbildet for berigelse af en bestemt histon modifikation ved anvendelse af sekvenser fra 3kb opstrøms for 3kb nedstrøms for deres transcription start sites (TSSs). Dette genererer en profil af berigelse af (A) H3K27me3 (K27) og (B) H3K4me3 (K4) Chip-seq analyser i hver gruppe. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den alsidighed af chip analyser beskrives i denne protokol kan bruges på forskellige væv, hvilket giver mulighed for at studere kromatin tilstand i en biologisk relevant system. CHIP eksperimenter under anvendelse af celler fra dyrkede systemer er bekvemt at udføre på grund stor mængde celler kan let opnås. Imidlertid har dyrkede celler ikke nødvendigvis celler i en multi-cellulære miljø. Ved at udvikle denne teknik ved hjælp af dissekeret væv fra levende dyr, kan vi tage fat på mange spørgsmål, som dyrkede celler ikke kan.
På trods af nytten af denne protokol, er der flere forbehold. For eksempel er det dissekerede væv stadig heterogen med flere forskellige celletyper. Mens relativt homogene celler kan opnås i Drosophila væv, såsom imaginære skiver og andre væv, såsom tarme, testes, og ovarier, som alle indeholder begrænsede voksne stamceller er heterogene. Denne komplikation kan være delvistløses ved hjælp af kraftfulde Drosophila genetik. For eksempel, skønt voksne stamceller findes i en lille population i væv beskrevet ovenfor og er ekstremt vanskelige at blive isoleret i et tilstrækkeligt antal af chip-analyse kan stamcellepopulation beriges ved hjælp af genetisk muterede baggrund. Bam genet er nødvendigt for stamcelle-differentiation i Drosophila germlinie linie 5,6. Derfor BAM mutante gonader er en god kilde til berigede udifferentierede kimceller. Ved at udføre chip bruger bam mutant, kan vi opnå en epigenomic landskab i udifferentierede kønsceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Keji Zhao laboratorium (NIH / NHLBI) for deres hjælp i at yde sekventering resultater. Vi vil også gerne takke UCSC genom projekt for brugen af Genome Browser til at visualisere kortlagt sekventering læser.
Dette arbejde er blevet støttet af R00HD055052 NIH Pathway til Independence Award og R01HD065816 fra NICHD, den Lucile Parkard Foundation, og Johns Hopkins University opstart midler til XC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco, Sigma-Aldrich | 47083-U | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet International | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystems | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5’ exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corp. | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
