Summary
최근 높은 처리량 시퀀싱 기술은 크게 염색질 Immunoprecipitation (칩) 실험의 감도를 증가하고 정화 셀 또는 해부 조직을 사용하여 응용 프로그램을하라는 메시지가있다. 여기에 칩 기술을 사용하는 방법을 윤곽을 그리다
Abstract
Epigenetics는 급속히 발전 분야 남아 그 염색질 상태가 서로 다른 개발 단계에서의 서로 다른 세포 유형에서 차동 유전자 발현에 기여하는 방법 연구. Epigenetic 규제는 성인의 배아 발달과 항상성 동안 세포 분화를 포함하여 생물 학적 과정의 광범위한 스펙트럼에 기여한다. epigenetic 연구에 중요한 전략은 다양한 히스톤 수정 및 염색질 요인이 유전자 발현을 조절하는 방법 검토하는 것입니다. 이것을 해결하기 위해, 염색질 Immunoprecipitation (CHIP)이 관심의 세포에있는 DNA와 특정 요인 협회의 스냅샷을 얻기 위해 널리 사용됩니다.
칩 기술은 일반적으로 재현할 데이터를 생성하기 위해 풍부하고 균질성에서 얻을 수 재료를 시작으로 교양 세포를 사용합니다. 그러나 몇 가지주의 사항이 있습니다 : 첫째, 배양 접시에있는 세포를 성장 환경은 따라서 생체내의 그것과는 차이가 있습니다살아있는 유기체의 세포 내생 염색질 상태를 반영하지. 둘째, 세포의 모든 유형은 교양 전직 생체내 될 수 있습니다. 사람들이 칩 분석을위한 충분한 자료를 얻을 수있는 세포 라인의 단지 제한된 수의이 있습니다.
여기 Drosophila 조직을 사용하여 칩 실험을 할 방법을 설명합니다. 시작 자료는 따라서 정확하게 내생 염색질 상태를 반영할 수, 살아있는 동물에서 조직을 해부하고 있습니다. 조직의 다양한 종류가있는이 방법의 적응성은 연구자 더 생물학적으로 많은 생체내 1, 2의 epigenetic 규제에 관한 관련 질문을 해결하실 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq)와 함께이 방법을 결합하면 더욱 연구자 epigenomic 풍경을 얻을 수 있습니다.
Protocol
(전체 칩 절차는 오버 일 정도 소요됩니다. 높은 처리량 시퀀싱을위한 칩 라이브러리의 작성은 다른 2~3일 소요됩니다.)
1. 해부 및 칩 실험 (~ 1,000,000 세포)에 대한 조직의 준비
- 차가운 PBS + 1X 프로 테아제 억제제 (7x 주식 솔루션을 얻기 위해 1.5 ML 1X PBS에서 테아제 억제제 칵테일 중 1 개의 펠릿를 해산)에서 (Drosophila testes의 예 2백쌍)에 관심있는 조직을 해부 + PMSF (최종 농도 100 μg / ml) 쇼핑. 두 조직을 씻어하고 억제제와 같은 PBS 용액 200 μL에 조직을 resuspend.
- 예제를 해결하려면, 5.5 μL 37%의 포름 알데히드를 (37 사용하기 전에 1 분 용 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 포름 알데히드) 추가합니다. 15 분 와동 사이에 매 5 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 2 분 동안 진정시킬 수 있도록 조직을 위해 얼음에 샘플을 놓습니다. 450 μL PBS (프로 테아제 억제제와 PMSF와)과 2X 린스. 샘플은 이제 매장이 될 수-20 ° C.에서 D 감자칩 충분한 자료를 얻기 위해 절개를 여러 번 반복합니다.
2. 칩 분석을위한 단백질의 DNA 결합으로 뜨는 준비
- 1.75 ML eppendorf 튜브의 단계 1.3에서 충분한 샘플을 결합.
- 조직 샘플에서 PBS를 제거합니다. 200 용해 버퍼의 μL (50 MM 트리스-HCL, pH를 7.6, 1 ㎜ CaCl2, 0.2 % 트리톤 X-100이나 NP-40, 5 밀리미터 butyrate 및 1X proteinase 억제제 칵테일). 추가 용해 완충액 (0.5 mm의 PMSF 최종 농도)로 신선한 PMSF 주식 솔루션을 추가합니다. 조직은 10 분 RT (실내 온도)에서 품어 모든 집계하지 않고 완전히 해리까지 파란 균 질기 (피셔 고양이 # 749521-1590)로 Homogenize.
- Sonication : 파워 20을 사용 microtip의 sonicator (Misonix HS-XL200). 50 초 동안 얼음에서 10 초 그리고 나머지 Sonicate. (이상 sonication 작은 조각을 얻을하므로 최적의 sonication 시간이, 경험적으로 결정되어야한다. histon 대한 항체를 사용하여 칩 4-5 회 반복전자 개조, 우리가 일반적으로 약 200-300 BP에 염색질 sonicate, 전사 인자 혹은 염색질 레귤레이터 (예 Polycomb 단백질)에 대해, 우리는 일반적 200-1000 BP에 염색질 sonicate. 그러나 최적의 조각 크기는 경험적으로 테스트해야합니다. 참고 : 항상에도 가열의 샘플을 방지하기 위해 SONICATING 동안 얼음 튜브를 유지!
- 1.8 ML RIPA 버퍼를 (추가하여 샘플을 희석 10 설명된대로 MM 트리스-HCL, 산도 7.6, 같은 농도에서 테아제 억제제와 PMSF와 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % SDS, 0.1 % 나-Deoxycholate, 1 % 트리톤 X-100, 이전에). 65에서 2 μL 5M NaCl과 부화를 추가하여 입력 컨트롤 등 40 μL를 저장 ° C crosslink를 반대하는 (O / N) 하룻밤 사이에.
- 구슬로 항체를 결합한하려면 1.5 ML eppendorf 튜브 40 μL 단백질에게 구슬을 추가한 후, 2 분 동안 4 ° C에서 600 μL PBS와 바위를 추가 자석에 구슬을 적용하고 뜨는 제거합니다. 100 PBS의 μL과 관심의 항체를 추가합니다 (항체의 양은 empir 결정한다ically). 4시간 1 시간 또는 4 ° C에 대한 RT에서 품어.
- 자석에 의해 구슬에서 뜨는 제거하고 단계 2.4부터 비즈에 1mL 염색질 추출물을 추가합니다. 4에서 회전 ° CO / N.
- 자석에 칩 샘플을 신청하고 뜨는 제거합니다. 십분 각각에 대해 4에서 다음 버퍼 ° C로 염주를 씻으십시오 :
RIPA 버퍼 1 ML과 2X [1.89 ML 'RIPA 버퍼'+ 315 μL 7x 테아제 억제제 + 20 μL PMSF];
RIPA 버퍼 1 ML과 2X + 0.3 M NaCl [1.89 ML RIPA 버퍼 + 220 μL 3 M NaCl];
LiCl 버퍼 1 ML (0.25 M LiCl, 0.5 % NP40, 0.5 % NaDOC)과 2X;
1X 1X TE의 1 ML과 + 0.2 % 트리톤 X-100;
1X TE 1 ML과 1X. - crosslink를 반대하려면, 100 μL TE 버퍼에 염주를 resuspend + 3 μL 10% SDS + proteinase K (20 밀리그램 / ML) 5 μL. 65 품어 ° CO / N.
- 자석에 구슬을 적용하고 새 튜브로 뜨는을 전송. 뜨는 당신의 DNA 샘플이 포함되어 있습니다. 100 μL TE + 0.5 M로 구슬을 씻는다NaCl은 두 뜨는을 결합.
- 페놀 - 클로로포름은 DNA 샘플을 추출합니다. Chlorofrom : : 200 μL 페놀 추가 IAA (25:24:1) 혼합 및 소용돌이. RT에서 5 분 14k에 봐. 또는 DNA는 Qiagen PCR 정화 키트를 사용하여 추출 할 수 있습니다.
- 새로운 튜브로 뜨는 / 수성 레이어를 양도, 20 μg / ML (또는 20 밀리그램 / 뜨는의 모든 일 ML에 대한 ML의 글리코겐 1 μL의 최종 농도에 선형 아크릴 아미드를 추가도 사용하실 수 있습니다. 글리코겐이 사용됩니다 선형 아크릴 아미드가 assays를 시퀀스에 사용되는 동안 후속 qPCR 또는 PCR 분석.) 3M NaOAc 20 μL와 500 μL 100 % EtOH를 추가합니다. 잘 섞어서 80에 품어 ° C를 10 분. 4에서 20 분 동안 최대 속도로 스핀 ° C.
- 뜨는 제거하고 300 μL 70 % EtOH로 씻는다. 50 μL TE 버퍼에 대기 건조하고 resuspend 샘플. 샘플은 지금 -20 ° C.에 저장될 수 시료는 정량 PCR (qPCR) 분석 (그림 1)을 위해 사용될 수 있습니다.
3A. qPCR을 사용하여 칩 에드 DNA를 분석
- undiluted, 1 / 10, 100분의 1, 1 / 1000, 5천분의 1 : 표준 곡선을 만들기 위해 다음과 같은 농도에서 게놈 DNA를 희석.
- 각 프라이머 쌍 들어, 단계 3a.1, 입력 제어 및 칩 에드의 DNA에서 게놈 DNA와 96 - 웰 플레이트에 중복으로 qPCR를 설정 :
10 μL 2X SYBR PCR 혼합 (Fermentas, K0222);
앞으로 1 μL 10 μm의 프라이머;
1 μL 10 μm의 역방향 프라이머;
X μL 칩 에드 DNA (입력 제어, 또는 게놈 DNA);
Y μL nuclease없는 H 2 O 20 μL로 반응 볼륨을 조정합니다. - 미니 플레이트 스피너 (Labnet)와 96 - 웰 플레이트를 봐.
- 다음과 같은 조건을 사용하여 ABI 7,300 실시간 PCR 시스템 (또는 기타 실시간 PCR 시스템)으로 qPCR을 수행합니다 :
1 단계 : 50 ° 2 분, 1주기위한 C;
2 단계 : 95 10 분, 1 사이클에 대한 ° C;
3 단계 : 95 ° 15 초, 60 ° C 1 분 용 C, 40 Cycles;
4 단계 (분리 단계) : 95 ° 15 초, 60 ° C 1 분, 95 용 C ° 15 s에 대한 C #. - 해리 곡선을 확인하십시오 : 열 분해 계획에서 하나의 피크는 PCR 반응에서 단일 amplicon을 제안합니다. 하나 이상의 피크는 프라이머 쌍과 비 특정 제품을 나타냅니다, qPCR 데이터는 사용하지 않아야합니다.
- 3A의 희석 게놈 DNA의 시리즈를 사용하여 표준 곡선을 기반으로 CT (사이클 한계) 값에 따라 DNA의 양을 해결 수식을 계산하여 각 프라이머 세트에 대한 PCR 반응의 기하 급수적인 증폭의 선형 단계를 결정합니다. 1.
- 칩 에드의 DNA 및 입력 컨트롤의 CT 값이 CT 가치의 선형 범위 내에있다면, 칩 에드 DNA와 2.4의 입력 컨트롤의 diluting 요인에 따라 칩 에드의 DNA 대 입력의 농축을 계산합니다.
3B. 높은 처리량의 시퀀싱을위한 칩 에드 DNA를 증폭.
- 칩 에드의 DNA 믹스의 최종 수리 (사용얼음 설정 Epicentre DNA를 최종 수리 키트) :
단계 2.12 (0.1-5 μg) 1-34 μl 게놈의 DNA
5 μl 10X 최종 수리 버퍼
5 μl dNTP 2.5 MM 믹스
5 μl 10 밀리미터 ATP
X μl H 2 O 49 μl로 반응 음량을 조절하려면
1 μl 최종 복구 효소 믹스 (T4의 DNA 중합 효소 + T4 폴리 뉴클레오 타이드의 키나제)
RT에서 45 분 동안 품어. Qiagen MinElute 반응을 사용하여 반응을 정화
정리 키트. 30 μl 용출 버퍼 (EB)에 Elute. - 3 '끝에 A-overhangs 추가 :
단계 3b.1에서 eluted DNA 제품의 30 μl
5 μl 10X 코 버퍼 # 2
10 μl 1 ㎜ dATP
2 μl DH 2 O
3 μl 5 U / μl Klenow의 조각 (3 '→ 5'엑소-)
37시 30 분 품어 ° C. MinElute ReactionCleanup 키트를 사용하여 반응을 정화. 10 μl EB에 Elute. - Solexa 링커 내고 :
단계 3b.2에서 eluted DNA를 10 μl
10 μl ddH 2 O
2.5 &무; 리터 10X T4의 DNA ligase 버퍼
Illumina에서 1 μl 아답터 oligo 믹스 (혈통 1/10-diluted)
2.5 μl T4의 DNA ligase (400 단위 / μl)
RT에서 1 시간 동안 알을 품다. MinElute ReactionCleanup 키트를 사용하여 반응을 정화. 20 μl EB에 Elute. 샘플은 지금 -20 ° C.에 저장될 수 - 전자 젤 장치를 사용하여 단계 3b.3에서 eluted DNA 샘플을 실행합니다. 겔에 300-500 BP 밴드를 분리하고 Qiagen 젤 추출 키트 (이 단계는 어댑터 oligo를 내고에서 ~ 125 BP 자체 출혈도 잡았 linkers을 제거)을 사용하여 정화. 12 μl EB에 Elute.
- Illumina에서 라이브러리 이점 엔드를 사용하여 (PE) primers를 증폭 :
단계 3b.4에서 eluted DNA의 10.5 μl
마스터 믹스의 12.5 μl (2X Phusion HF, Finnzymes)
PE1 PCR의 프라이머 1 개 중 1 μl
PE2 PCR의 프라이머 2 개 중 1 μl
PCR 조건 :
98 ° C ~ 30에 해당하는 초
(98 ° C 10 초, 65 ° C 30 초, 72 ° C에서 30 초), 반복 20주기
15 분 72 ° C에서. - 단계 3b.5의 표본 표준 2퍼센트 아가로 오스 겔을 사용하여 적절한 크기의 DNA (300-500 BP)를 선택한 후 칩 seq 사용할 수 있습니다. 샘플은 지금 -20 ° C.에 저장될 수 그것은 오염을 방지하기위한 하나의 겔에서 각 칩 샘플을 분리하는 것이 좋습니다. 샘플은 높은 처리량 시퀀싱을 위해 제출할 수 있습니다.
3C. Solexa 파이프라인 분석
- 25-BP 시퀀싱 읽고는 Illumina 게놈 분석기 (GA) 파이프라인에서 얻은되었다.
- 모든 읽기가 참조 시퀀스 두 불일치 최대 있도록 큰 영양 (뉴클레오 티드 데이터의 효율적인 로컬 정렬) 소프트웨어를 사용 Drosophila 게놈 (dm3)으로 정렬되었습니다.
- 유니 클리 매핑 읽기는 스트림 분석을 위해 유지되었다. 여러 개의 동일한 읽기의 경우 최대 3 사본은 PCR 증폭의 편견의 가능성을 줄이기 위해 유지되었다.
- GA의 파이프라인의 출력은 브라우저의 확장 가능한 데이터 (침대) 파일로 변환되었습니다.
- 생성하려면시각화를위한 UCSC 브라우저에 업로드를위한 가발 파일, 우리는 창 크기 등 네 BP와 DNA를 조각 크기로 160 BP로 이전 발행물 3에서 설명한되었습니다 비단뱀 짐보 따리를 사용했습니다.
- 침묵과 표현의 유전자에 Drosophila의 유전자를 분류하기 위해, 우리는 RPKM이라는 디지털 숫자 (kilobase 당 /은 exonic 지역을 병합 / 만 당 매핑된가 읽고 읽습니다) 사용됩니다. RPKM = 0과 유전자 RPKM가 ≥ 1, 낮은 적당한 높은 표현 수준 유전자로 세 subgroups로 나눌 수 표현 그룹으로 분류되었다와 침묵 그룹 및 유전자로 분류하고, 각 그룹에 대해 같은 번호를 가지고 있었다 유전자.
- 히스톤 수정 수준과 유전자 발현을 비교하기 위해, 우리는 이전 게시물 3에서 설명한되었습니다 파이썬 스크립트를 사용했습니다.
4. 대표 결과
웅을 사용하여 칩 qPCR 결과의 예 (구슬의 가방) 돌연변이 testes은 그림 1 4에 표시됩니다. 빵 testes에서 proliferative spermatogonia에서 spermatocytes 5, 6을 차별로의 전환에 실패 있습니다. 우리는이 조직 유형에 풍부하고 undifferentiated 배아 세포에 대한 소스로 빵 testes를 사용합니다. 이러한 남성 특정 전사 인자 87 (mst87F), 돈 주앙 (DJ) 및 퍼지 양파 (fzo)와 같은 정자 분화에 필요한 차별화의 유전자는, 빵 testes로 표현되지 않습니다. 이 유전자는 매우 억압 H3K27me3 히스톤 수정 7 (그림 1A)와 풍부한 있지만 활성 H3K4me3 히스톤 수정 8 (그림 1B), 우리가 'monovalent'일곱이라는 염색질 서명없는 상태입니다. H3K27me3 또는 H3K4me3 중의 농축은 constitutively 표현 Cyclin (CycA) 유전자 4 정규화에 의해 결정됩니다.
빵 돌연변이의 testes은 (그림 2) 그림 1에 표시된 qPCR 결과를 확인. 세 가지 테스트 터미널 차별화의 유전자에 대한 mst87F, DJ와 fzo과 항체의 동일한 집합 (즉 억압 H3K27me3 적극 H3K4me3)를 사용하여 콘텐츠 "> 칩 seq 분석 그들의 게놈 영역은 매우 H3K27me3 있지만 H3K4me3 (그림 2A-2C)로 풍부합니다. 반대로 constitutively 표현 CycA 유전자는 상당한 H3K4me3 있지만 전사 시작 사이트 (TSS) (그림 2D) 근처의 작은 H3K27me3 구속력이 있습니다.또한, differentially 표현 유전자 네 가지 클래스 TSSs 근처 H3K27me3과 H3K4me3의 칩 프로파일은 각 히스톤 수정의 기능과 일치합니다. 다른 이름으로 그림 3A와 같이 TSSs의 H3K27me3 하류의 농축은 반대 유전자 발현 수준과 서로 관련됩니다. 침묵 유전자 반면에 높은 H3K27me3을 가지고높은 표현 유전자는 더 H3K27me3 구속력이 없습니다. 이러한 데이터는 유전자 발현에 H3K27me3의 억압 역할과 일치합니다. 반대로, TSSs 주위 H3K4me3의 농축은 유전자 발현에 H3K4me3의 적극적인 역할과 일치하는 유전자 발현 수준 (그림 3B)와 반대로 상관 관계를 보여주었다.
어느 억압 H3K27me3 히스톤 변형 (A) 또는 (b) 웅 셀 - 농축 undifferentiated 돌연변 testes에서 활동중인 H3K4me3 히스톤 변형에 대한 항체를 사용하여 칩 에드 DNA의 그림 1. qPCR 분석. () 빵에 testes, 차별화의 유전자는 (Mst87F, DJ, fzo) H3K27me3 억압 히스톤 변형에 풍부합니다. (B) 분화의 유전자는 H3K4me3 활성 마크 소진됩니다. 대상 유전자 (Mst87F, DJ 또는 fzo)에서 칩 DNA의 수준 (칩 DNA / 입력)이 먼저 레바로 정상화되었다 컨트롤 CycA 유전자에 칩 DNA의 엘. 오차 막대는 세 독립적인 생물의 표준 편차가 복제를 나타냅니다.
그림 2. UCSC 게놈 브라우저 H3K27me3의 스냅샷 및 () Mst87F가 (B) DJ와 (C) fzo, (D) CycA의 유전자.는 (D)에서 H3K27me3 강화 지역을 동그라미의 전체 게놈 영역에 걸쳐 H3K4me3 농축도의 염색질 상태를 반영 웅에 미천한 표시됩니다 중복 유전자 CG7264, testes (RPKM = 1)하지만 높은 야생 형 testes로 표현 (RPKM = 130) 8 (7에서 칩 seq 데이터). 그림 1 칩 결과의 정량 PCR 분석에 사용되는 프로브는 각 플롯의 하단에 표시된있다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
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그림 3. 칩 seq 프로필 testes 7 웅에 H3K27me3 및 H3K4me3을 사용합니다. 네 가지 유전자 그룹 (7,509 유전자)는 RNA-seq 결과 8 일 기준으로 자신의 유전자 발현 수준에 따라 분류되었다. 유전자의 대표적인 클래스들은 전사 시작 사이트 (TSSs)의 3킬로바이트 상류에 3킬로바이트 스트림의 시퀀스를 사용하여 특정 히스톤 수정의 농축을 위해 꾸몄다됩니다. 이것은 () H3K27me3 (K27)와 각 그룹에서 (B) H3K4me3 (K4) 칩 seq 분석가.의 농축의 프로필을 생성하는 더 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오를 .
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Discussion
이 프로토콜에서 언급한 칩 분석의 다양성은 생물학적으로 관련 시스템에 염색질 상태를 공부할 수있는 기회를 제공하는 다른 조직에 사용할 수 있습니다. 교양 시스템에서 세포를 이용한 칩 실험은 세포의 대량 쉽게 얻을 수 있기 때문에 수행할 편리합니다. 그러나 교양 전지는 반드시 멀티 셀룰러 환경에서 세포를 반영하지 않습니다. 살아있는 동물의 해부 조직을 이용해이 기술을 개발함으로써 우리는 많은 질문을 해결할 수있는 교양 세포가 안돼요.
이 프로토콜의 유용에도 불구하고, 몇 가지주의 사항이 있습니다. 예를 들어, 해부하는 조직은 여전히 여러 가지 세포 유형과 이기종입니다. 비교적 균일한 세포와 같은 imaginal 디스크, 내장과 같은 다른 조직, testes, 모든 제한된 성인 줄기 세포를 포함하는 이기종 있습니다 난소와 같은 Drosophila 조직에서 얻을 수 있지만. 이러한 합병증은 부분적으로 수강력한 Drosophila 유전자를 사용하여 해결. 성인 줄기 세포는 위에서 설명한 조직의 작은 인구에 존재와 칩 분석을위한 충분한 숫자에서 격리되어야하기가 매우 어렵습니다 있지만 예를 들어, 줄기 세포 인구는 유전자 변이 배경을 사용하여 풍부하게 할 수 있습니다. 빵 유전자는 Drosophila germline 혈통 5,6에서 줄기 세포 분화에 필요한 것입니다. 따라서 빵 돌연변이 생식선은 풍부한 undifferentiated 배아 세포에 대한 좋은 소스입니다. 빵 돌연변를 사용하여 칩이 수행함으로써, 우리는 undifferentiated 배아 세포에서 epigenomic 풍경을 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
저자 시퀀스 결과를 제공하는 그들의 도움 박사 Keji 조의 연구소 (NIH / NHLBI)에 감사드립니다. 우리는 또한 매핑 시퀀싱 읽은을 시각화하기위한 게놈 브라우저의 사용을 위해 UCSC 게놈 프로젝트를 감사드립니다.
이 작품은 신생 XC로 자금 NICHD, Lucile Parkard 재단, 그리고 존스 홉킨스 대학에서 독립 수상 및 R01HD065816에 R00HD055052 NIH 경로에 의해 지원되었습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco, Sigma-Aldrich | 47083-U | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet International | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystems | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5’ exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corp. | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
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