Summary
मापने भ्रूण और नवजात चूहों में बाएं निलय (LV) दबाव में वर्णित है. दबाव एक तरल पदार्थ से भरे एक transducer जुड़ा एल.वी. में अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन के तहत सुई डालने से मापा जाता है. देखभाल करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल दौरान सामान्य हृदय समारोह को बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए.
Protocol
1. अल्ट्रासाउंड और दबाव प्रणाली
- निर्माताओं (Vevo 770, Visualsonics) के निर्देशों के अनुसार अल्ट्रासाउंड प्रणाली शुरू करो. आसुत जल के साथ अल्ट्रासाउंड प्रणाली से कनेक्ट करने के लिए उचित जांच (E18 उम्र P7 = 708 मॉडल, उम्र> P7 = 707B मॉडल) भरें. लगभग एक इमेजिंग मंच पर घुड़सवार इतना है कि एल.वी. शीर्ष इंजेक्शन हाथ की ओर इशारा है माउस के लिए एक एल.वी. लंबी अक्ष दृश्य प्राप्त करने के लिए आवश्यक अभिविन्यास में समायोज्य स्टैंड में जांच रखें.
- दबाव प्रणाली एक तरल पदार्थ से भरे दबाव transducer, पुल प्रवर्धक, डाटा अधिग्रहण प्रणाली और डेटा रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर (LabChart) के होते हैं. कनेक्शन तीन तरह stopcocks, टयूबिंग, Luer ताले और नली अकड़ से मिलकर बनता है. एक 20 एमएल सिरिंज के 10% के एक छोर पर निस्तब्धता के लिए heparinized खारा के साथ भरा है. दूसरे छोर सुई को जोड़ता है और एक 3 एमएल सिरिंज शरीर इंजेक्शन हाथ (चित्रा 1) में सुई टयूबिंग पकड़ आवरण के रूप में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है.
- सुई और अल्ट्रासाउंड प्रणाली के इंजेक्शन हाथ में टयूबिंग आवरण माउंट. इमेजिंग मंच की अनुमानित ऊंचाई पर एक अंगूठी स्टैंड में दबाव transducer दबाना. सुई टयूबिंग के लिए एक माउस की उम्र (पी 3 = 30g, उम्र पी 3 => 25G उम्र E18) के लिए उपयुक्त सुई देते हैं. छोटे सुई आसान हैं, और सीने में दीवार के माध्यम से अग्रिम, और एक धीमी प्रतिक्रिया समय है मुश्किल भरा मिलता है. इसलिए, सबसे बड़ी सुई आकार कि एल.वी. लुमेन में फिट बैठता है हर उम्र के लिए प्रयोग किया जाता है.
- इमेजिंग मंच पर अल्ट्रासाउंड जेल का एक टीला प्लेस और ध्यान से जांच समायोज्य खड़ा है ताकि जेल में सुई सीधे कर सकते हैं इमेजिंग जांच (चित्रा 2) के केंद्र के तहत उन्नत का उपयोग लाइन. सुई जांच के नीचे तक पर्याप्त होना चाहिए पंचर, नहीं जांच कवर लेकिन पास जांच फोकल गहराई भीतर करने के लिए पर्याप्त है. यदि आवश्यक हो, तो सुई हाथ से तुला किया जा सकता है इतना है कि यह वीं में रहता हैई अपनी यात्रा के दौरान सही विमान.
- संरेखण को बनाए रखने, सुई वापस लेना और इमेजिंग जांच बढ़ाने के लिए इमेजिंग मंच पर एक माउस जगह. कि टिप में दर्ज हो सकता है किसी भी जेल को खत्म करने के लिए सुई फ्लश.
2. माउस तैयारी
- इस प्रोटोकॉल में दिखाया तरीकों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. एक समय गर्भवती (E18) मां या नवजात माउस (20 P1) 1.5% isoflurane की निरंतर साँस लेना चतनाशून्य करना. टयूबिंग एक मानक नाक शंकु में डाला जा सकता है एक जल्दी नवजात माउस (P1 - 15) के छोटे सिर को समायोजित.
- एल.वी. शीर्ष इंजेक्शन हाथ की ओर इशारा कर के साथ एक पृष्ठीय decubitus स्थिति में अल्ट्रासाउंड प्रणाली का इमेजिंग मंच के लिए माउस को सुरक्षित करो. गर्भवती माताओं के लिए, अल्ट्रासाउंड जेल लागू करने के लिए संलग्न ईसीजी डिटेक्टर के साथ हृदय की दर पर नजर रखने और शरीर के तापमान की प्रतिक्रिया नियंत्रण के लिए गुदा थर्मामीटर डालें. नवजात चूहों बहुत छोटा चया इन डिटेक्टरों, तो हृदय की दर को दबाव माप के दौरान निगरानी रखी जाती है और शरीर का तापमान एक बाहरी गर्मी दीपक के साथ बनाए रखा है.
- गर्भवती या एक लोमनाशक क्रीम के साथ युवा माउस की माँ की छाती के पेट से बालों को हटाने. नवजात चूहों (P1 - 10) किसी भी बालों को हटाने की आवश्यकता नहीं है.
- गर्भवती माताओं के लिए विदारक कैंची और घुमावदार संदंश का उपयोग पेट खुला काटा. बाह्यरूप प्रदान करना एक गर्भाशय और धुंध पर सींग जगह गर्म खारा समाधान के साथ सिक्त. सावधानी से उचित एक parasternal एल.वी. की लंबी अक्ष दृश्य अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग प्राप्त करने के की स्थिति में एक भ्रूण में हेरफेर. अन्य गर्भाशय सींग externalizing से पहले इस तरफ सभी भ्रूण में दबाव मापने के लिए. सभी भ्रूण और गर्म खारा की आवधिक अलावा के साथ नम माँ के पेट रखें.
3. दबाव माप
- जगह prewarmed, भ्रूण या नवजात माउस के पर degassed अल्ट्रासाउंड जेल. नवजात चूहों कि घ नहीं किया गया हैepilated अल्ट्रासाउंड जेल की एक छोटी राशि है उनके सीने पर मला से पहले शेष अल्ट्रासाउंड जेल के लिए युग्मन बढ़ाने के लिए लागू किया जाता है होना चाहिए. इमेजिंग जांच के निचले हिस्से और इमेजिंग मंच के कोण समायोजित करने के लिए एक इष्टतम parasternal एल.वी. लंबे अक्ष दृश्य प्राप्त. जांच के कोण क्या समायोजित क्योंकि सुई संरेखण खो जाएगा नहीं है.
- जबकि अल्ट्रासाउंड स्क्रीन पर से एल.वी. छवि की निगरानी, सुई धीरे से अग्रिम जब तक यह जांच के तल के पास है. सुई और जांच स्थिति को समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, है संरेखण पाली सही. धीरे से नमक के साथ सुई फ्लश. शुरू रिकॉर्डिंग दबाव डेटा और दबाव transducer LabChart सॉफ्टवेयर के साथ शून्य. transducer तापमान और स्थिति के साथ से drifts, तो यह महत्वपूर्ण है प्रत्येक माउस में दबाव मापने के पहले सिर्फ शून्य है.
- धीरे धीरे सुई अग्रिम जब तक यह अल्ट्रासाउंड छवि के किनारे पर देखा जा सकता है, लेकिन नहीं एल.वी. में अभी तक. सुई की स्थिति को समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, पर एल.वी. में प्रवेश करने के लिएसुप्रीम. यदि आवश्यक हो, जांच की स्थिति के लिए सुई का एक स्पष्ट छवि बनाए रखने के समायोजित करें. एल.वी. लुमेन (चित्रा 3) में सुई अग्रिम, जबकि दबाव डेटा रिकॉर्डिंग और अल्ट्रासाउंड छवि पर सुई स्थान की निगरानी. दबाव transducer से काँपने के गुणवाला रिकॉर्डिंग की शुरुआत एल.वी. लुमेन अंदर स्थान (चित्रा 4) की पुष्टि करता है.
- यदि सुई के एल.वी. लुमेन में प्रतीत होता है, लेकिन दबाव रिकॉर्डिंग काँपने के गुणवाला, नहीं कर रहे हैं सिरिंज सवार पर एक प्रकाश नल के साथ फ्लश, अभी तक एक दबाव में वृद्धि (के बारे में 5 - 10 μL मात्रा) का पता चला है. यह किसी भी मोज़री कि एक सटीक पढ़ने को रोकने जा सकता है स्पष्ट करना चाहिए. यदि दबाव रीडिंग अभी भी काँपने के गुणवाला नहीं कर रहे हैं, सुई सही विमान के ऊपर या नीचे हो सकता है और एल.वी. लुमेन में नहीं डाला जा सकता है. सुई वापस लेना, खारा, और अग्रिम के साथ फिर से फ्लश. यदि काँपने के गुणवाला रीडिंग अभी भी नहीं प्राप्त कर रहे हैं, अगले माउस पर चलते हैं. प्रत्येक माउस के लिए एक नई सुई का प्रयोग करें.
- सफल दबाव रीडिंग 75% से प्राप्त किया जा सकता हैभ्रूण और नवजात चूहों का प्रयास किया. रीडिंग 5 लेना चाहिए - प्रत्येक 10 मिनट और एक माउस के लिए दबाव डेटा अगर दिल की दर उम्मीद से काफी अलग हैं शामिल नहीं होना चाहिए (चित्रा 5A). दिल की दर हृदय उपायों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है और बदल दिल दर हृदय संकट का संकेत कर रहे हैं है. भ्रूण संकट आम तौर पर 1 होता है गर्भाशय की पहली बाह्यीभवन के बाद 1.5 घंटे, ताकि गति एक पूरी कूड़े में दबाव को मापने के लिए महत्वपूर्ण है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
सभी परिणाम दिखाए C57BL6J चूहों के लिए कर रहे हैं. एल.वी. लुमेन में सुई की एक छवि एक P1 में 3 चित्र में दिखाया माउस के लिए. सुई छाती दीवार पंचर करने के लिए आवश्यक है और छोटे एल.वी. लुमेन के लिए पहुँच प्राप्त है, लेकिन यह काफी दबाव प्रणाली की प्रतिक्रिया समय बढ़ जाती है. जब दबाव में लगभग एक कदम वृद्धि मैन्युअल रूप से सिस्टम को लागू किया जाता है, अधिकतम दबाव के 67% तक पहुंचने में समय से .067ग केवल (सबसे अधिक संभावना वास्तविक दबाव कदम को लागू करने के लिए समय का संकेत) टयूबिंग के साथ, एक 25 जी और एक 30 जी सुई के साथ सुई 0.529 सेकंड के साथ 0.105 सेकंड. अधिकतम दबाव तक पहुँचने में देरी पूर्ण चित्रा 4A और 4C में दिखाया tracings में देखा जा सकता है. हालांकि प्रतिक्रिया समय 30g सुई के साथ धीमी है, तरंग बेहतर भ्रूण और नवजात जल्दी चरणों में कब्जा कर लिया है, क्योंकि हृदय की दर को 5 चूहों में उम्र के साथ बढ़ जाती है. इस सीमा के बावजूद, systolic दबाव यह सोचते हैं कि सच एल.वी. diastolic दबाव (न्यूनतम) शून्य है की गणना जा सकता है, और सिस्टोलिक (अधिकतम) एल.वी. दबाव में दो बार मतलब एल.वी. स्थिर अवस्था में रीडिंग (चित्र 4B और 4D निर्धारित दबाव है ) 6. यह आम तौर पर माना जाता है कि सिस्टोलिक एल.वी. और धमनियों के दबाव के बराबर हैं. दिल की दर को मापा और E18 और p14 के बीच विभिन्न युगों की गणना के लिए एल.वी. दबाव चित्रा 5 में दिखाया जाता है.
चित्रा 1 संलग्न तीन तरह stopcocks, (एम) पुरुष और महिला (एफ) Luer ताला कनेक्शन, नली अकड़, टयूबिंग, सीरिंज और सुई के साथ दबाव transducer की छवि.
चित्रा 2 की छवि स्थापित इमेजिंग जांच (ए) के साथ सुई संरेखित करें. इमेजिंग मंच घुमाया ताकि माउस की एल.वी. शीर्ष इंजेक्शन हाथ का सामना करना पड़ रहा है. जांच समायोज्य स्टैंड में लगभग आवश्यक अभिविन्यास में मुहिम शुरू की है एक एल.वी. छवि लंबी अक्ष प्राप्त है. सुई टयूबिंग आवरण इंजेक्शन बांह में मुहिम शुरू की है. सुई अल्ट्रासाउंड जेल का एक टीला में इमेजिंग के लिए उचित और इमेजिंग जांच (बी) के लिए सम्मान के साथ कोण ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज स्थिति को निर्धारित मंच पर उन्नत है.
चित्रा 3. सुई (एन) की छवि छाती दीवार (CW) के माध्यम से उन्नत औरएल.वी. एक P1 माउस में लुमेन में. पैमाने बार = 0.1 मिमी.
चित्रा 4 उदाहरण काँपने के गुणवाला दबाव रीडिंग के रूप में सुई (ए) E18 और p14 (सी) माउस के एल.वी. में प्रवेश करती है. वहाँ एक स्थिर सुई जुड़ी प्रणाली की प्रतिक्रिया समय के कारण राज्य तक पहुँचने में देरी है. ज़ूम स्थिर राज्य में रीडिंग के विचार बी और डी नोट कि न्यूनतम E18 एल.वी. दबाव शून्य के पास में दिखाए जाते हैं, लेकिन शून्य से अधिकतम दबाव पूर्ण तरंग p14 चूहों के उच्च दिल की दर पर दर्ज नहीं किया जा सकता है. मतलब दबाव स्थिर राज्य रीडिंग से मापा जाता है और यह माना जाता है कि एल.वी. सिस्टोलिक = 2 दबाव मापा एक्स दबाव मतलब.
चित्रा 5 मापाकरे दिल दर (ए) और E18 के लिए (बी) की गणना सिस्टोलिक एल.वी. दबाव p14 चूहों. एन = पी 3 के लिए E18, P1, 22 के लिए 5 के लिए 7, P7 के लिए और 23 p14 के लिए 16
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल देर से भ्रूण और जल्दी नवजात चूहों में एल.वी. दबाव मापने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल के मुख्य सीमा के दबाव प्रणाली के अस्थायी समाधान है. दबाव संकेत के रूप में सुई के माध्यम से एल.वी. से यात्रा transducer, और केवल मतलब दबाव मान दर्ज किया जा सकता है अवमन्दित है. भिगोना सबसे बड़ा संभव सुई का उपयोग करके कम किया जा सकता है, लेकिन सुई एल.वी. लुमेन में विभिन्न आयु वर्ग के चूहों के लिए फिट होगा. क्योंकि diastolic दबाव शून्य के रूप में किया जा सकता है approximated, एल.वी. और फलस्वरूप धमनियों systolic दबाव मतलब एल.वी. दबाव माप से गणना की जा सकती है. हालांकि अतिरिक्त धमनी चर आदर्श हो सकता है (यानी नाड़ी दबाव), systolic दबाव माउस विकास के दौरान हृदय और हृदय प्रणाली पर exerted बलों के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल का लाभ आसानी गति और उच्च throughpu के लिए माप repeatability केविभिन्न माउस जीनोटाइप या उपचार प्रोटोकॉल के टी तुलना. महत्वपूर्ण विकास के चरणों में systolic दबाव मापने के द्वारा, हम यांत्रिक बलों और परिणामस्वरूप हृदय और हृदय और मानव रोग में संरचना और समारोह के बीच परस्पर क्रिया को समझने के लिए शुरू कर सकते हैं.
ठोस राज्य कैथेटर दबाव मापन के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है और तरल पदार्थ से भरे transducers के तुलना में बेहतर अस्थायी समाधान है. ठोस राज्य माउस कैथेटर के लिए मानक आकार 1.0F (0.33 मिमी, मिलर), 1.2F (0.4 मिमी, Scisense) या 1.4F (0.47 मिमी, मिलर) हैं. हम अच्छे में 1.2F Scisense कैथेटर और 1.4F मिलर कैथेटर के साथ p30 चूहों के साथ P21 से बड़े चूहों में धमनी दबाव रीडिंग प्राप्त करते हैं. हम p14 चूहों में 1.0F मिलर कैथेटर की कोशिश की है, लेकिन संगत धमनी दबाव रीडिंग नहीं था. P21 चूहों में, हम एक 1.2F Scisense कैथेटर से धमनी दबाव के साथ हमारे सिस्टोलिक एल.वी. दबाव मापन की तुलना में. गणना सिस्टोलिक एल.वी. रक्तसभी चूहों (67 ± mmHg 5) के लिए दबाव लगातार सिस्टोलिक धमनी दबाव (87 ± 9 mmHg) की तुलना में कम था और बहुत मतलब धमनी (65 ± mmHg 8) दबाव ठोस राज्य कैथेटर के साथ मापा के लिए करीब है, लेकिन दोनों कैथेटर 5 जीनोटाइप के बीच महत्वपूर्ण अंतर की पहचान. इस कारण से, हम केवल E18 के लिए P20 चूहों के लिए में वर्णित एल.वी. दबाव विधि सलाह देते हैं. खींच प्लास्टिक कैथेटर तरल पदार्थ से भरे दबाव transducers के लिए संलग्न किया जा सकता है और मन्या धमनी के माध्यम से उन्नत करने के लिए धमनीय दाब मापन 3 प्राप्त है. लेकिन, इस प्रणाली को अभी भी केवल रिकॉर्ड दबाव माप का मतलब है और हमारे हाथ में अधिक समय लगता था और एक उच्च असफलता की दर से एल.वी. दबाव मापन यहाँ प्रस्तुत किया था. सहायक अशक्त दबाव प्रणाली (विश्व परिशुद्धता उपकरण) छोटे दबाव मापने के लिए उच्च संकल्प है और बेहतर अस्थायी संकल्प 4 है. हालांकि, सहायक अशक्त सिस्टम nonconductive micropipettes, आमतौर पर जीएल की आवश्यकतागधा, माप साइट है कि बड़े चूहों की छाती दीवार के माध्यम से उन्नत नहीं किया जा सकता है में प्रविष्टि के लिए.
चतनाशून्य करनेवाली औषधि प्रभाव जब जाग चूहों को इन दबाव मापन extrapolating के विचार किया जाना चाहिए. यह दिखाया गया है कि isoflurane प्रभाव हृदय 10 न्यूनतम करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प है और अगर एक ही विधि के साथ सभी चूहों संवेदनाहृत हैं, विभिन्न समूहों के बीच तुलना मान्य होगा. भ्रूण और नवजात चूहों मानक ईसीजी और इमेजिंग मंच पर तापमान जांच के लिए बहुत छोटे हैं. हृदय की दर दबाव रिकॉर्डिंग में और पिटाई एल.वी. की अल्ट्रासाउंड स्क्रीन पर दृश्य द्वारा निगरानी की जानी चाहिए. चूहों कि बहुत धीमी गति से दिल की दर को दिखाने के हृदय की संकट में हो और दबाव विश्लेषण में शामिल नहीं हो सकता है. चूहों गर्म रखा जाना चाहिए और भ्रूण चूहों प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल भर नम रखा जाना चाहिए. अन्य जांचकर्ताओं तरीके से तैयार की है गर्म शारीरिक सलिन में भ्रूण विसर्जितइमेजिंग अवधि के दौरान 11 ई, लेकिन हमने पाया है कि एक गर्मी दीपक और गर्म खारा की नियमित रूप से आवेदन संक्षिप्त प्रयोगात्मक समय अवधि के दौरान दिल की दर की उम्मीद के साथ स्वस्थ भ्रूण को बनाए रखने के लिए पर्याप्त हैं. जोखिम समय के रूप में लंबे समय के रूप में लगभग एक घंटे के लिए रखा जाता है, हम पहली और आखिरी मापा भ्रूण के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता देखा नहीं है, लेकिन माप जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए एक पूरी कूड़े पर डेटा इकट्ठा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम, भाग में एनआईएच HL087653 और HL105314 अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया है. तरीकों में से कुछ चिकित्सा के वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल में डॉ. रॉबर्ट Mecham की प्रयोगशाला में विकसित किए गए.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High resolution ultrasound system | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | Or other appropriate ultrasound system |
| High frequency ultrasound probes | VisualSonics, inc. | 708 and 707B | |
| Imaging platform and injection arm | VisualSonics, inc. | Imaging Station 2 | With ECG and temperature feedback control of platform |
| Pressure transducer | ADInstruments | MLT 844 | |
| Bridge amplifier | ADInstruments | ML221 | |
| Data acquisition system | ADInstruments | ML866 | |
| Data recording software | ADInstruments | LabChart | |
| Ring stand and clamp | Various | To hold pressure transducer during measurements | |
| 3-way stopcocks with luer connections, male lock | Cole-Parmer | 30600-02 | |
| 1/16" ID Tygon Tubing | Cole-Parmer | 06408 | |
| Male and female luers w/ 1/16" hose barb | Cole-Parmer | 45510-50 45510-00 | |
| 24" tubing with male and female luer at each end | Cole-Parmer | 30600-60 | |
| 3 and 10 mL syringes | BD Biosciences | ||
| 30 and 25G needles | BD Biosciences | 1.5 inches in length | |
| Big Ben manometer | Riester | 1456-100 | |
| Saline | Various | ||
| Heparin | Various | ||
| Ultrasound gel | Parker Hannifin Corporation | Aquasonic 100 | |
| Hair remover lotion | Nair |
References
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