Måling af tryk i venstre ventrikel i slutningen af ​​embryoner og neonatale mus

Summary

Måling tryk i venstre ventrikel (LV) i embryoniske og neonatale mus er beskrevet. Trykket måles ved at indsætte en nål forbundet til en væskefyldt transduceren i LV ved hjælp af ultralyd. Må drages omsorg for at opretholde normal hjertefunktion i forsøgsprotokollen.

Abstract

Blodtrykket stiger betydeligt under fosterudviklingen og postnatal udvikling hos hvirveldyr. Hos mus, er blodstrømmen første påviselige omkring embryonisk dag (E) 8,5 ^1. Systolisk venstre ventrikel (LV) tryk er 2 mm Hg ved E9.5 og 11 mmHg ved E14.5 ^2. Ved disse midten fosterstadiet er LV tydeligt gennem brystvæggen for invasive trykmålinger fordi ribberne og huden ikke er fuldt udviklet. Mellem E14.5 og fødsel (ca. E21) billeddiagnostiske metoder skal bruges til at se LV. Efter fødslen, gennemsnitligt arterietryk stiger fra 30 - 70 mmHg fra postnatal dag (P) 2-35 ^3. Ud over P20, kan blodtryk måles med solid state-katetre (dvs. Millar eller Scisense). Før P20, er disse katetre for stor til at udvikle mus arterier og arterielt tryk skal måles med brugerdefinerede trukket plastik katetre knyttet til væskefyldte tryktransducere ³ eller glas mikropipetter attgjorde ondt at servo null tryktransducere ^4.

Vores seneste arbejde har vist, at den største stigning i blodtrykket sker i de sene embryonale til tidlige postnatale periode i mus ^5-7. Denne store stigning i blodtrykket kan have indflydelse på glat-muskelcelle (SMC) fænotype i udviklingslandene arterier og udløse vigtige mechanotransduction begivenheder. I sygdomme hos mennesker, hvor de mekaniske egenskaber af udviklingslandenes arterier er kompromitteret af defekter i ekstracellulære matrixproteiner (dvs. Marfan Syndrom ⁸ og Supravalvulær aortastenose ⁹⁾ de hurtige ændringer i blodtrykket i løbet af denne periode kan bidrage til sygdommens fænotype og sværhedsgrad gennem ændringer i mechanotransduction signaler. Derfor er det vigtigt at være i stand til at måle ændringer i blodtrykket i slutningen embryonisk og den neonatale periode i musemodeller for human sygdom.

Beskriver vi en fremgangsmåde til måling LV-tryk i slutningenembryonale (E18) og tidlige postnatale (P1 - 20) mus. En nål fastgjort til en væskefyldt tryktransducer indsat i LV ved hjælp af ultralyd. Omhu for at opretholde normal hjertefunktion i forsøgsprotokollen, især for de embryoniske mus. Repræsentative data præsenteres og begrænsninger af protokollen drøftes.

Protocol

1. Ultralyd og tryksystem

1. Starte ultralyd-systemet ifølge producentens instruktioner (Vevo 770, Visualsonics). Fyld den passende probe (alder E18 - P7 = model 708, alder> P7 = model 707B) med destilleret vand og forbindelse til ultralydssystemet. Placere sonden i det justerbare stand på ca orientering nødvendig for at opnå en LV lange akse visning for en mus monteret på billeddannelse platformen, således at LV toppunkt peger mod injektionsenden arm.
2. Trykket Systemet består af en væskefyldt tryktransducer, bro forstærker, datafangstsystem og registrering af data software (LabChart). De forbindelser består af tre-vejs stophaner, slanger, luer låse og modhager. En 20 ml sprøjte fyldt med 10% hepariniseret saltopløsning til skylning i den ene ende. Den anden ende forbundet til en nål og en 3 ml sprøjte legeme er modificeret til anvendelse som et hylster til at holde nålen slangen i injektionen armen (figur 1).
3. Monter nålen slange og hus i injektion arm af ultralyd system. Fastspænde tryktransducer i en ring stand på tilnærmelsesvise højde af det billeddannende platformen. Sæt en nål passende for en alder af musen (alder E18 - P3 = 30G, alder> P3 = 25G) til nålen slangen. Rundp bliver tilstoppet lettere, er vanskeligere at frem gennem brystvæggen og har en langsommere responstid. Derfor er den største pinde, der passer i LV lumen anvendes til hver alder.
4. Placere en bunke af ultralyd gel på den billeddannende platformen og omhyggeligt kø sonden ved hjælp af justerbare standeren, så at nålen kan fremføres direkte til gelen under midten af ​​den billeddannende proben (figur 2). Nålen skal være tilstrækkeligt langt under proben til ikke punktere sondeafdækning, men tæt nok til at være inden for sonden fokale dybde. Hvis det er nødvendigt, kan nålen bøjes manuelt, således at det forbliver i the rigtige plan hele sin vandring.
5. Fastholdelse af tilpasning, trække nålen og hæve billedbehandling sonden at placere en mus i billeddannelsesproduktet platformen. Skyl nålen til at fjerne enhver gel, der kan have indtastet spidsen.

2. Mus forberedelse

1. Alle metoder er vist i denne protokol er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg. Bedøver en tidsindstillet gravid mor (E18) eller neonatal mus (P1 - 20) ved kontinuerlig inhalation af 1,5% isofluran. Slangen kan indsættes i en standard næsekegle at rumme lille hoved af en tidlig neonatal mus (P1 - 15).
2. Fastgør mus til billeddannelse platform ultralyd system i en dorsal liggende stilling med LV spidsen peger mod injektionen armen. For gravide mødre, gælder ultralyd gel til at overvåge puls med den vedhæftede EKG detektor og indsætte rektalt termometer til feedback styring af kropstemperaturen. Neonatale mus er for små feller disse detektorer, så puls overvåges under trykmåling og kropstemperaturen opretholdes med en ekstern varme lampe.
3. Fjern hår fra maven af ​​den gravide mor eller brystet af den unge mus med et hårfjerningsmiddel. Neonatale mus (P1 - 10) ikke kræver nogen hårfjerning.
4. For gravide mødre, skar maven ved hjælp af dissekere saks og buede pincet. Eksternalisere en livmoderhorn og sted på gaze fugtet med varmt saltvand. Omhyggeligt manipulere en embryo i den korrekte position for at opnå en parasternale længdeakse afbildning af LV hjælp af ultralydsonden. Måling af trykket i alle embryoer på denne side, før eksternalisering anden livmoderhorn. Hold alle embryoner og maven på moderen fugtig med periodevis tilsætning af varmt saltvand.

3. Trykmåling

1. Place varmet, afgasset ultralyd gel på embryonale eller neonatal mus. Neonatale mus, der ikke har været depilated bør have en lille mængde af ultralyd gel gnides på brystet, før den resterende ultralyd gel anvendes til at forbedre koblingen. Sænke billeddannelse proben og justere vinklen af ​​den billeddannende platformen for at opnå en optimal parasternale LV længdeakse synspunkt. Må ikke justere vinklen af ​​sonden, fordi nålen tilpasning vil være tabt.
2. Under overvågning LV billedet på ultralyd skærmen langsomt frem nålen, indtil den er nær ved bunden af ​​proben. Justere nålen og probeplacering, hvis det er nødvendigt at korrigere justering forskydninger. Forsigtigt skylle kanyle med saltvand. Begynder at optage trykdata og nul tryktransduceren med LabChart software. Transduceren driver med temperaturen og position, så det er vigtigt at nul, lige før måling af tryk i hver mus.
3. Langsomt frem nålen, indtil den kan ses på kanten af ​​ultralyd-billede, men endnu ikke i LV. Juster nåleposition, hvis det er nødvendigt, at indtaste LV påspids. Justere probeplacering, hvis det er nødvendigt at opretholde et klart billede af nålen. Før nålen i LV lumen (fig. 3), mens registrering trykdata og overvågning nålen placering på ultralydbilledet. Begyndelsen af ​​pulserende optagelser fra tryktransduceren bekræfter placeringen inde i LV lumen (figur 4).
4. Hvis nålen synes at være i LV lumen, men tryk optagelser er ikke pulserende flugter med en let tryk på sprøjtens stempel, lige indtil en trykforøgelse registreres (ca. 5-10 gl volumen). Dette bør fjerne alle træsko, der kan forhindre en nøjagtig aflæsning. Hvis trykudlæsninger stadig ikke pulserende, kan nålen være over eller under det korrekte plan og ikke skal indsættes i LV lumen. Træk nålen, skylle med saltvand, og gå igen. Hvis pulserende aflæsninger stadig ikke fået, gå videre til næste musen. Anvendes en ny nål for hver mus.
5. Vellykkede trykudlæsninger kan opnås fra 75% afde embryoniske og neonatale mus forsøgt. Målinger bør tage 5 - 10 minutter hver, og de trykdata for en mus bør ikke medtages, hvis hjertet er markant anderledes end forventet (fig. 5A). Puls har en signifikant effekt på hjerte-kar-foranstaltninger, og ændrede hjertefrekvens er tegn på kardial lidelse. Embryonisk angst sker normalt 1 - 1,5 timer efter den første udlægning af livmoderen, så hastigheden vigtig for at måle trykket i hele kuld.

4. Repræsentative resultater

Alle viste resultater er for C57BL6J mus. Et billede af nålen i LV lumen for en P1 mus i vist i figur 3. Nålen er nødvendig for at punktere brystvæggen og få adgang til den lille LV lumen, men signifikant forøger reaktionstid tryksystem. Når en omtrentlig trin trykstigning manuelt til systemet, den tid til at nå 67% af det maksimale tryk er 0,067 seC med slangen alene (sandsynligvis indikerer realtid at anvende tryk trin), 0,105 sek med en 25 G nål og 0,529 sekunder med en 30 G nål. Forsinkelsen i at nå maksimale tryk kan ses i de komplette kurver er vist i figur 4A og 4C. Selv om reaktionen er langsommere med 30G nål, er bølgeformen bedre fanget i de embryoniske og tidlig neonatale fase, fordi hjertet stiger med alderen hos mus ^5. På trods af denne begrænsning kan det systoliske tryk beregnes antagelse, at den sande LV diastoliske (minimum) tryk er nul, og det systoliske (maksimum) LV tryk to gange den gennemsnitlige LV tryk bestemmes ud fra aflæsninger ved steady state (fig. 4B og 4D ) ^6. Det antages generelt, at det systoliske LV og arterielle tryk er ens. De målte hjertefrekvens og beregnede LV tryk for forskellige aldre mellem E18 og P14 er vist i figur 5.

Figur 1. Billede af tryktransduceren med vedhæftede tre-vejs stophaner, mandlige (M) og kvindelige (F) luer lock forbindelser, modhager, slanger, sprøjter og nåle.

Figur 2. Billede af sat op til at bringe nålen med det billeddannende probe (A). Den billeddannende platformen er drejet således, at LV spids mus står injektionen arm. Sonden er monteret i det justerbare stand på ca orientering nødvendig for at opnå en LV lang akse billede. Nålen rør foringsrøret er monteret i sprøjteenheden armen. Nålen fremføres i en bunke af ultralyd gel på den billeddannende platformen for at bestemme den korrekte vinkel og lodret og vandret stilling i forhold til det billeddannende probe (B).

Figur 3. Billede af nålen (N) fremføres gennem brystvæggen (CW) ogi LV lumen i et P1 mus. Målestokken = 0,1 mm.

Figur 4. Eksempel pulserende trykaflæsninger som nålen trænger ind i LV af en E18 (A) og P14 (C) mus. Der er en forsinkelse i at nå en stabil tilstand på grund af reaktionstiden for systemet med nålen fastgjort. Zoom udsigt over aflæsninger ved steady state er vist i B og D. Bemærk, at de mindstekrav, E18 LV pres er nær nul, men den fulde bølgeform fra nul til det maksimale tryk kan ikke blive optaget på de højere hjerte satser P14 mus. De gennemsnitlige tryk er målt fra steady state aflæsninger, og det antages, at LV systoliske blodtryk = 2 x målt betyder tryk.

Figur 5 målte puls (A) og beregnede systoliske LV tryk (B) til E18 -. P14 mus. N = 7 for E18, 5 for P1, 22 for P3, 23 for P7 og 16 for P14

Discussion

Protokollen præsenteres her tilvejebringer en fremgangsmåde til måling af LV-tryk i slutningen embryonisk og begyndelsen neonatale mus. Den væsentligste begrænsning af denne protokol er den tidsmæssige opløsning af tryksystem. Tryksignalet dæmpes, når den bevæger af LV gennem nålen til transduceren, og kun middeltrykket værdier kan registreres. Dæmpningen kan minimeres ved hjælp af størst nålen er muligt, men nålen skal passe ind i LV lumen for forskellige ældede mus. Fordi det diastoliske tryk kan tilnærmes som nul, kan LV og dermed arterielle systoliske blodtryk beregnes ud fra de gennemsnitlige LV trykmålinger. Selv om yderligere arterielle variabler ville være ideelt (dvs. pulstryk), det systoliske tryk tilvejebringer værdifuld information om de kræfter, der udøves på hjerte-og kardiovaskulære system i mus udvikling. Fordelene ved denne protokol er den lethed, hurtighed og repeterbarhed af målingerne for høj throughput sammenligning af forskellige mus genotyper eller behandling protokoller. Ved at måle det systoliske tryk på kritiske udviklingsstadier, kan vi begynde at forstå samspillet mellem mekaniske kræfter og den deraf følgende hjerte-og hjerte-kar-struktur og funktion i human sygdom.

Solid-state katetre betragtes som guldstandarden til trykmåling og har overlegen tidsmæssig opløsning i forhold til væskefyldte transducere. De standardstørrelser for solid-state mus katetre er 1.0F (0,33 mm, Millar), 1.2F (0,4 mm, Scisense) eller 1.4F (0,47 mm, Millar). Vi får gode arterielle trykudlæsninger i mus ældre end P21 med 1.2F Scisense kateter og P30 mus med 1.4F Millar kateter. Vi har prøvet 1.0F Millar kateter i P14 mus, men ikke får ensartede arterielle trykmålinger. I P21 mus, sammenlignede vi vores systoliske LV trykmåling med arterielle pres fra en 1.2F Scisense kateter. Den beregnede systoliske LV blodtryk (67 ± 5 mm Hg) for alle mus var konsekvent mindre end det systoliske blodtryk (87 ± 9 mmHg) og var meget tæt på det gennemsnitlige arterielle tryk (65 ± 8 mm Hg) målt med solid state-kateter, men begge katetre identificeret betydelige forskelle mellem genotyper ^5. Af denne grund anbefaler vi den beskrevne LV presset metode kun til E18 til P20 mus. Trukket-plastkatetre kan fastgøres til væskefyldte tryktransducere og fremføres gennem carotisarterien til opnåelse arterielle trykmålinger ^3. Men dette system stadig kun registreringer betyder trykmålinger og i vore hænder var mere tidskrævende og havde en højere fejlrate end LV trykmålinger præsenteret her. Servo-nul tryksystemer (World Precision Instruments) har en højere opløsning for at måle små belastninger og har bedre tidsopløsning ^4. Imidlertid servo-nul systemer kræver ledende mikropipetter, sædvanligvis glæsel til indføring i målestedet, som ikke kan fremføres gennem brystvæggen af ​​ældre mus.

Bedøvende virkninger skal overvejes, når ekstrapolation af disse trykmålinger at vågne mus. Det er blevet vist, at isofluran er det bedste valg for at minimere cardiovaskulære virkninger ^10, og hvis alle mus bedøvet med den samme fremgangsmåde, vil sammenligninger mellem forskellige grupper være gyldig. De embryonale og neonatal mus er for små til standard EKG og temperaturfølere på billedechippen platformen. Pulsen skal overvåges i de tryk optagelser og visualisering af at slå LV på ultralyd skærmen. Alle mus, som er meget langsom puls kan være i hjertets nød og ikke bør medtages i trykket analysen. Musene skal holdes varm og embryonale mus holdes fugtig i hele den eksperimentelle protokol. Andre forskere har udviklet metoder til at fordybe embryoner i varmt fysiologisk Saline hele billeddannelse periode ^11, men vi har fundet, at en varmelampe og regelmæssig anvendelse af varm saltopløsning er tilstrækkelig til at opretholde sunde fostre med de forventede hjertefrekvenser under den korte eksperimentelle periode. Så længe eksponeringstid holdes på cirka en time, har vi ikke observeret signifikant variation mellem den første og sidste målte embryo, men målingerne skal udføres hurtigt at indsamle data om en hel kuld.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High resolution ultrasound system	VisualSonics, inc.	Vevo 770	Or other appropriate ultrasound system
High frequency ultrasound probes	VisualSonics, inc.	708 and 707B
Imaging platform and injection arm	VisualSonics, inc.	Imaging Station 2	With ECG and temperature feedback control of platform
Pressure transducer	ADInstruments	MLT 844
Bridge amplifier	ADInstruments	ML221
Data acquisition system	ADInstruments	ML866
Data recording software	ADInstruments	LabChart
Ring stand and clamp	Various		To hold pressure transducer during measurements
3-way stopcocks with luer connections, male lock	Cole-Parmer	30600-02
1/16" ID Tygon Tubing	Cole-Parmer	06408
Male and female luers w/ 1/16" hose barb	Cole-Parmer	45510-50 45510-00
24" tubing with male and female luer at each end	Cole-Parmer	30600-60
3 and 10 mL syringes	BD Biosciences
30 and 25G needles	BD Biosciences		1.5 inches in length
Big Ben manometer	Riester	1456-100
Saline	Various
Heparin	Various
Ultrasound gel	Parker Hannifin Corporation	Aquasonic 100
Hair remover lotion	Nair