Summary
Het meten van linker ventrikel druk (LV) in embryonale en neonatale muizen wordt beschreven. De druk wordt gemeten door het inbrengen van een naald is aangesloten op een met vloeistof gevulde transducer in de LV onder echografische begeleiding. Er moet worden normaal hartfunctie handhaven tijdens de experimentele protocol.
Abstract
De bloeddruk stijgt aanzienlijk tijdens de embryonale en postnatale ontwikkeling van gewervelde dieren. In de muis, de doorbloeding is in de eerste detecteerbaar rond embryonale dag (E) 8.5 1. Systolische linker ventrikel (LV) druk is 2 mmHg bij E9.5 en 11 mmHg bij E14.5 2. Bij deze mid-embryonale stadia, de LV is duidelijk zichtbaar door de borstwand voor invasieve drukmetingen, omdat de ribben en de huid nog niet volledig ontwikkeld. Tussen E14.5 en geboorte (ongeveer E21) imaging methoden moeten worden gebruikt om de LV te bekijken. Na de geboorte, gemiddelde arteriële druk stijgt 30 tot 70 mmHg van de dagen na de geboorte (P) 2 - 35 3. Beyond P20, kan arteriële druk gemeten worden met solid-state katheters (dat wil zeggen Millar of Scisense). Voor P20, deze katheters zijn te groot voor de ontwikkeling van de muis slagaders en de arteriële druk moet worden gemeten met aangepaste getrokken plastic katheters aan met vloeistof gevulde druktransducers 3 of glas micropipetten attdeed pijn om servo null druktransducers 4.
Onze recente werk heeft aangetoond dat de grootste stijging van de bloeddruk optreedt tijdens het einde van de embryonale om vroege postnatale periode bij muizen 5-7. Deze grote stijging van de bloeddruk kunnen beïnvloeden gladde spiercellen (SMC) fenotype bij de ontwikkeling van bloedvaten en leiden tot belangrijke mechanotransductie gebeurtenissen. Ziekten bij de mens, waar de mechanische eigenschappen van de ontwikkeling van bloedvaten in het gedrang komen door gebreken in de extracellulaire matrix eiwitten (dat wil zeggen Marfan syndroom 8 en supravalvulaire aortastenose 9) de snelle veranderingen in de bloeddruk tijdens deze periode kan bijdragen aan de ziekte van fenotype en de ernst door middel van veranderingen in mechanotransductie signalen. Daarom is het belangrijk te kunnen veranderingen in de bloeddruk te meten tijdens late embryonale en neonatale perioden muismodellen van menselijke ziekten.
Wij beschrijven een werkwijze voor het meten LV druk eindembryonale (E18) en de vroege postnatale (P1 - 20) muizen. Een naald bevestigd aan een met vloeistof gevulde drukopnemer is aangesloten op de LV onder echografische begeleiding. Er wordt op normale hartfunctie handhaven tijdens de experimentele protocol, vooral voor de embryonale muizen. Representatieve gegevens worden gepresenteerd en de beperkingen van het protocol worden besproken.
Protocol
1. Echografie en druk systeem
- Start de ultrasone volgens de instructies van de fabrikant (Vevo 770 Visualsonics). Vul de juiste sonde (leeftijd E18 - P7 = model 708, leeftijd> P7 = model 707B) met gedestilleerd water en maak verbinding met de echo systeem. Plaats de sonde in de verstelbare standaard op de geschatte oriëntatie nodig is om een LS-lange-as weergave voor een muis gemonteerd op de imaging platform, zodat de LV apex is gericht op de injectie arm te verkrijgen.
- De druk bestaat uit een met vloeistof gevulde druksensor brugversterker, meetsysteem en gegevensopslag software (LabChart). De aansluitingen bestaan uit drie-weg kranen, buizen, luer sloten en slang weerhaakjes. Een 20 ml injectiespuit gevuld met 10% gehepariniseerde zoutoplossing spoelen aan een uiteinde. Het andere uiteinde verbonden met een naald en 3 mL spuit lichaam aangepast voor gebruik als een behuizing voor de naald buis te houden in de injectie arm (figuur 1).
- Monteer de naald buizen en behuizing in de injectie arm van de ultrasound systeem. Klem de drukopnemer in een ring stand op de geschatte hoogte van de imaging platform. Bevestig een naald geschikt is voor de leeftijd van de muis (leeftijd E18 - P3 = 30G, leeftijd> P3 = 25G) om de naald slang. Kleinere naalden verstopt raken makkelijker, moeilijker om door de borstwand, en een tragere reactietijd te hebben. Daarom wordt het grootste naalden die past in de LV lumen voor elke leeftijd.
- Plaats een berg ultrasone gel op het beeldelement platform en zorgvuldig dusdanig dat de probe met de verstelbare voet, zodat de naald direct worden aangevoerd naar de gel onder het midden van de afbeeldingsonde (figuur 2). De naald moet ver genoeg onder de sonde niet doorboren de sonde cover, maar dichtbij genoeg om binnen de sonde scherptediepte. Indien nodig kan de naald worden gebogen met de hand zodat blijft in the juiste vliegtuig gedurende zijn reizen.
- Instandhouding van de uitlijning, trekt u de naald en breng de imaging probe om een muis te plaatsen op de imaging platform. Spoel de naald op een gel die is aangegaan de tip te elimineren.
2. Muis voorbereiding
- Alle methoden die in dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite. Verdoof een getimede zwangere moeder (E18) of neonatale muis (P1 - 20) door middel van continue inademing van 1,5% isofluraan. Buis is in een standaard neuskegel de kleine kop van een vroege neonatale muis (P1 - 15) passen.
- Zet de muis om de beeldvorming platform van de ultrasone systeem in een dorsale decubitus positie met de LV apex de richting van de injectie arm. Voor zwangere moeders, van toepassing ultrasound gel om de hartslag te controleren met de bijgevoegde ECG-detector en de rectale thermometer te voegen voor feedback controle van de lichaamstemperatuur. Neonatale muizen zijn te klein fof deze detectoren, zodat de hartslag wordt gecontroleerd tijdens de druk metingen en lichaamstemperatuur in stand wordt gehouden met een externe warmte lamp.
- Haal haar uit de buik van de zwangere moeder of de borst van de jonge muis met een ontharingscrème. Neonatale muizen (P1 - 10) behoeven geen ontharing.
- Voor zwangere moeders, opengesneden de buik met behulp van het ontleden van een schaar en gebogen tang. Externaliseren een baarmoeder hoorn en leg ze op gaas bevochtigd met warm zoutoplossing. Voorzichtig manipuleren een embryo in de juiste positie om een parasternale lange as uitzicht op de LV met behulp van het echoapparaat te verkrijgen. Meet de druk in alle embryo's van deze zijde bij het uitbesteden andere baarmoedertak. Houd alle embryo's en de buik van de moeder vochtig met periodieke toevoeging van warme zoutoplossing.
3. Drukmeting
- Plaats voorverwarmd, ontgast echografie gel op de embryonale of neonatale muis. Neonatale muizen die niet zijn dgeëpileerd moet een kleine hoeveelheid van ultrageluid gel ingesmeerd de borst voordat het resterende ultrasone gel wordt toegepast koppeling verbeteren. Laat de imaging sensor en stel de hoek van de imaging platform voor een optimale parasternale LV lange as zicht te verkrijgen. Pas de hoek van de sonde, omdat de naald uitlijning verloren.
- Terwijl het toezicht op de LV beeld op de echo scherm, langzaam vooruit de naald totdat het in de buurt van de onderkant van de sonde. De naald en probe positie, indien nodig, uitlijning verschuivingen corrigeren. Voorzichtig spoelen de naald met een zoutoplossing. Start de opname druk gegevens en nul de druksensor met de LabChart software. De omzetter drijft de temperatuur en positie, dus is het belangrijk om alleen nul voordat meten van de druk in elke muis.
- Langzaam voer de naald totdat het kan worden gezien aan de rand van de echo beeld, maar nog niet in de LV. Pas de positie van de naald, indien nodig, om de LV betreden op hettop. Stel de probe positie, indien nodig, om een duidelijk beeld van de naald te houden. Advance de naald in de LV lumen (figuur 3), tijdens het opnemen van de druk van gegevens en monitoring van de naald locatie op de echobeeld. Het begin van pulsvormige opnamen van de druksensor wordt bevestigd de locatie in de LV lumen (figuur 4).
- Als de naald lijkt te zijn in de LV lumen, maar de druk opnames zijn niet pulsatiele, vlak met een lichte tik op de zuigerstang, enkel tot de druk wordt gedetecteerd (ongeveer 5 - 10 pl volume). Op deze manier moeten alle klompen die kunnen worden voorkomen dat een nauwkeurige meting. Als drukwaarden nog niet pulserend, kan de naald boven of onder de juiste vlak en niet worden opgenomen in de LV lumen. Trek de naald, spoel dan nogmaals met een zoutoplossing, en vooraf. Als pulsatiele metingen nog steeds niet zijn verkregen, op naar de volgende muis. Gebruik een nieuwe naald voor elke muis.
- Succesvolle drukmetingen kan worden verkregen bij 75% van dede embryonale en neonatale muizen geprobeerd. Metingen moeten 5 - 10 minuten per stuk en de druk gegevens voor een muis moet niet worden opgenomen als de hartslag is significant verschillend dan verwacht (figuur 5A). De hartslag heeft een significant effect op hart-maatregelen en veranderde hartslag zijn een indicatie van hartklachten. Embryonale nood komt meestal 1 - 1,5 uur na de eerste uitbesteding van de baarmoeder, dus snelheid is belangrijk voor het meten van de druk in een heel nest.
4. Representatieve resultaten
Alle getoonde resultaten zijn voor C57BL6J muizen. Een beeld van de naald in de LV lumen een P1 muis in figuur 3. De naald moet prikken de borstwand toegang tot de kleine LV lumen, maar verhoogt de reactietijd van het druksysteem. Bij een benadering stap drukverhoging handmatig wordt toegepast op het systeem, de tijd tot 67% van de maximale druk bereikt is 0,067 sec met de slang alleen (waarschijnlijk een indicatie van de real-time om de druk stap van toepassing zijn), 0,105 sec met een 25 G naald en 0,529 sec met een 30 G naald. De vertraging bij het bereiken maximale druk te zien in de volledig tracings figuur 4A en 4C. Hoewel de responstijd is trager met de 30G naald, wordt de golfvorm beter gevangen op de embryonale en vroege neonatale fase, omdat de hartslag toeneemt met de leeftijd bij muizen 5. Ondanks deze beperking kan de systolische druk berekend uitgaande dat de ware diastolische (minimum) druk nul is en de systolische (maximum) LV druk tweemaal de gemiddelde LV druk bepaald door de waarden steady state (figuur 4B en 4D ) 6. Algemeen wordt aangenomen dat de systolische en LV arteriële druk gelijk zijn. De gemeten hartslag en berekend LV druk voor verschillende leeftijden tussen de E18 en P14 zijn weergegeven in figuur 5.
Figuur 1. Afbeelding van de druksensor met aangehechte driewegafsluiters, man (M) en vrouwelijke (F) luer lock aansluitingen, slang weerhaken, slangen, spuiten en naald.
Figuur 2. Afbeelding van de opzet om de naald af te stemmen op de imaging-sonde (A). De imaging platform wordt zo gedraaid dat de LV apex van de muis wordt de injectie arm geconfronteerd. De sonde is aangebracht in de verstelbare voet op de geschatte oriëntatie nodig een LV lange as beeld te verkrijgen. De naald buis behuizing is gemonteerd in de injectie arm. De naald wordt voortbewogen naar een berg ultrasone gel op het beeldvormende platform om de juiste hoek verticale en horizontale positie ten opzichte van de afbeeldingsonde (B) te bepalen.
Figuur 3. Afbeelding van de naald (N) verstrekt door de borstwand (CW) enin de LV lumen in een P1 muis. Schaal bar = 0,1 mm.
Figuur 4. Voorbeeld pulsvormige drukwaarden de naald de LV van E18 (A) en P14 (C) muis komt. Er is een vertraging in het bereiken van een stabiele toestand door de responsietijd van het systeem met de naald. Zoom uitzicht op de metingen bij steady-state worden getoond in B en D. Merk op dat de minimale E18 LV drukken zijn bijna nul, maar de volledige golfvorm van nul tot de maximale druk kan niet worden opgenomen op de hogere hartslag van P14 muizen. De gemiddelde druk wordt gemeten vanaf de stationaire toestand metingen en aangenomen wordt dat LV systolische = 2 x gemeten druk verstaan.
Figuur 5 Gemeten hartslag (A) en berekend systolische LV druk (B) voor E18 -. P14 muizen. N = 7 voor E18, 5 voor P1, 22 voor P3, 23 voor P7 en 16 P14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde een werkwijze voor het meten van de druk LV eind embryonale en vroege neonatale muizen. De belangrijkste beperking van dit protocol is de temporele resolutie van het druksysteem. De druk signaal wordt gedempt als het reizen van de LV door de naald van de transducer, en alleen maar betekenen drukwaarden kunnen worden opgenomen. De demping kan worden geminimaliseerd door gebruik te maken van de grootste naald mogelijk, maar de naald moet binnen de LV lumen geschikt is voor verschillende oude muizen. Omdat de diastolische druk kan worden benaderd als nul, kan de LV en daarmee arteriële systolische druk worden berekend op basis van de gemiddelde LV drukmetingen. Hoewel extra arteriële variabelen zou ideaal (bijvoorbeeld puls), de systolische druk waardevolle informatie over de krachten uitgeoefend op de cardiale en cardiovasculaire systeem tijdens ontwikkeling van de muis. De voordelen van dit protocol zijn het gemak, de snelheid en de herhaalbaarheid van de metingen voor hoge throughput vergelijking van verschillende genotypen muis of behandelingsprotocollen. Door het meten van de systolische druk op kritische ontwikkelingsstadia, kunnen we beginnen met de wisselwerking tussen mechanische krachten en de daaruit voortvloeiende hart-en cardiovasculaire structuur en functie van ziekten bij de mens te begrijpen.
Solid-state katheters worden beschouwd als de gouden standaard voor drukmetingen en hebben een superieure temporele resolutie ten opzichte van met vloeistof gevulde transducers. De standaard maten voor de solid-state muis katheters zijn 1.0F (0,33 mm, Millar), 1.2F (0,4 mm, Scisense) of 1.4F (0,47 mm, Millar). We krijgen een goede arteriële drukmetingen bij muizen ouder dan P21 met de 1.2F Scisense katheter en P30 muizen met de 1.4F Millar katheter. We hebben geprobeerd de 1.0F Millar katheter in P14 muizen, maar kreeg niet consistent arteriële druk metingen. In P21 muizen, hebben we onze systolische LV drukmetingen in vergelijking met arteriële druk van een 1.2F Scisense katheter. De berekende systolische LV bloeddruk (67 ± 5 mmHg) voor alle muizen was steeds lager dan de systolische arteriële druk (87 ± 9 mm Hg) en was zeer dicht bij de gemiddelde arteriële druk (65 ± 8 mmHg) gemeten met de solid-state katheter, maar beide katheters van een significante verschillen tussen de genotypen 5. Om deze reden adviseren wij de beschreven LV druk-methode alleen voor E18 tot P20 muizen. Getrokken kunststof katheters kan aan vloeistof gevulde drukopnemers en voortbewogen door de halsslagader verkrijgen arteriële drukmetingen 3. Maar, dit systeem nog steeds alleen records gemiddelde druk metingen en in onze handen was meer tijd in beslag en hadden een hogere uitval dan de LV drukmetingen hier gepresenteerd. Servo-null druk systemen (World precisie-instrumenten) hebben een hogere resolutie voor het meten van kleine druk en hebben een betere temporele resolutie 4. Echter, servo-null systemen vereisen niet-geleidende micropipetten, meestal glkont, voor gebruik in de bepaling plaats die niet kunnen worden voortbewogen door de borstwand oudere muizen.
Verdovende effecten moet rekening worden gehouden bij de extrapolatie van deze drukmetingen om wakker te muizen. Gebleken is dat isofluraan de beste keuze ter beperking cardiovasculaire effecten 10 en als alle muizen verdoofd met dezelfde wijze vergelijkingen tussen verschillende groepen geldig. De embryonale en neonatale muizen zijn te klein voor de standaard ECG-en temperatuursensoren op de imaging platform. De hartslag moet worden gecontroleerd bij de druk opnames en door de visualisatie van het kloppende LV op de echo scherm. Alle muizen die heel traag hartslag zien kunnen zijn in hartklachten en moet niet worden opgenomen in de druk analyse. De muizen moeten warm gehouden worden en embryonale muizen moet vochtig worden gehouden in de experimentele protocol. Andere onderzoekers hebben ontworpen methoden om de embryo's onder te dompelen in warm fysiologische Saline gedurende de beeldvorming periode van 11, maar we hebben ontdekt dat een warmte lamp en regelmatige toepassing van warme zout is voldoende om een gezonde embryo's met de verwachte hartslag tijdens de korte experimentele periode te handhaven. Zolang als de belichtingstijd wordt beperkt tot ongeveer een uur, hebben we niet waargenomen significante verschillen tussen de gemeten eerste en de laatste embryo, maar de metingen moeten snel worden uitgevoerd om gegevens over een heel nest te verzamelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd, voor een deel, door de NIH subsidies HL087653 en HL105314. Sommige van de methoden werden ontwikkeld in het laboratorium van Dr Robert Mecham aan de Washington University School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High resolution ultrasound system | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | Or other appropriate ultrasound system |
| High frequency ultrasound probes | VisualSonics, inc. | 708 and 707B | |
| Imaging platform and injection arm | VisualSonics, inc. | Imaging Station 2 | With ECG and temperature feedback control of platform |
| Pressure transducer | ADInstruments | MLT 844 | |
| Bridge amplifier | ADInstruments | ML221 | |
| Data acquisition system | ADInstruments | ML866 | |
| Data recording software | ADInstruments | LabChart | |
| Ring stand and clamp | Various | To hold pressure transducer during measurements | |
| 3-way stopcocks with luer connections, male lock | Cole-Parmer | 30600-02 | |
| 1/16" ID Tygon Tubing | Cole-Parmer | 06408 | |
| Male and female luers w/ 1/16" hose barb | Cole-Parmer | 45510-50 45510-00 | |
| 24" tubing with male and female luer at each end | Cole-Parmer | 30600-60 | |
| 3 and 10 mL syringes | BD Biosciences | ||
| 30 and 25G needles | BD Biosciences | 1.5 inches in length | |
| Big Ben manometer | Riester | 1456-100 | |
| Saline | Various | ||
| Heparin | Various | ||
| Ultrasound gel | Parker Hannifin Corporation | Aquasonic 100 | |
| Hair remover lotion | Nair |
References
- Ji, R. P. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S. Developmental changes in ventricular diastolic function correlate with changes in ventricular myoarchitecture in normal mouse embryos. Circ. Res. 93 (9), 857-865 (2003).
- Huang, Y., Guo, X., Kassab, G. S. Axial nonuniformity of geometric and mechanical properties of mouse aorta is increased during postnatal growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290 (2), H657-H664 (2006).
- Ishii, T., Kuwaki, T., Masuda, Y., Fukuda, Y. Postnatal development of blood pressure and baroreflex in mice. Auton. Neurosci. 94 (1-2), 34-41 (2001).
- Le, V. P., Knutsen, R. H., Mecham, R. P., Wagenseil, J. E. Decreased aortic diameter and compliance precedes blood pressure increases in postnatal development of elastin-insufficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2011).
- Wagenseil, J. E. Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice. Circ. Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).
- Wagenseil, J. E. The importance of elastin to aortic development in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (2), H257-H264 (2010).
- Ramirez, F., Sakai, L. Y., Rifkin, D. B., Dietz, H. C. Extracellular microfibrils in development and disease. Cell. Mol. Life Sci. 64 (18), 2437-2446 (2007).
- Li, D. Y. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum. Mol. Genet. 6 (7), 1021-1028 (1997).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60 (1), 14-21 (2006).
