Måling Venstre ventrikkels Trykket i sen Embryonale og Neonatal Mus

Summary

Måling venstre ventrikkel trykk (LV) i embryonale og neonatal mus er beskrevet. Trykket måles ved å sette inn en nål tilkoblet en væskefylt svingeren i LV i henhold til ultralyd veiledning. Det må tas for å opprettholde normal hjertefunksjon under forsøksprotokoll.

Abstract

Blodtrykket øker vesentlig i løpet av embryo-og postnatal utvikling i virveldyr. I mus, er blodstrømmen første påvisbare rundt embryonale dag (E) 8.5 ^1. Systolisk venstre ventrikkel (LV) trykket er 2 mmHg ved E9.5 og 11 mmHg ved E14.5 ^to. På disse mid-embryonale stadier, er det LV godt synlig gjennom brystveggen for invasive trykkmålinger fordi ribbeina og huden ikke er fullt utviklet. Mellom E14.5 og fødsel (ca. E21) imaging metoder må brukes for å vise LV. Etter fødselen, mener arterielle trykket øker fra 30 - 70 mmHg fra postnatal dag (P) 2 - 35 ^3. Beyond P20, kan arterietrykk måles med solid-state kateter (dvs. Millar eller Scisense). Før P20, disse katetrene er for store for å utvikle mus arterier og arterietrykk må måles med custom trukket plast katetre knyttet til væskefylte trykk transdusere ³ eller glass mikropipetter ATTverket til servo null press svingere ^4.

Vårt siste arbeid har vist at den største økningen i blodtrykk oppstår i løpet av slutten fosterstadiet til tidlig postnatal periode i mus ^5-7. Denne store økningen i blodtrykk kan påvirke glatt muskelcelle (SMC) fenotypen i utviklingsland arterier og utløse viktige mechanotransduction hendelser. I menneskelig sykdom, hvor de mekaniske egenskapene til utviklingsland arterier blir kompromittert av feil i ekstracellulære matrix proteiner (dvs. Marfans syndrom ⁸ og Supravalvular Aortastenose ⁹⁾ de raske endringer i blodtrykk i løpet av denne perioden kan bidra til sykdom fenotype og alvorlighetsgrad gjennom endringer i mechanotransduction signaler. Derfor er det viktig å kunne måle blodtrykk forandringer i løpet av slutten av embryonale og neonatale perioder i musemodeller av sykdom hos mennesker.

Vi beskriver en metode for måling LV press i slutten avembryonale (E18) og tidlige postnatale (P1 - 20) mus. En nål festet til en væskefylt trykkgiver settes inn i LV i henhold til ultralyd veiledning. Care er tatt for å opprettholde normal hjertefunksjon under forsøksprotokoll, spesielt for de embryonale mus. Representative data presenteres og begrensninger av protokollen blir diskutert.

Protocol

1. Ultralyd og trykk system

1. Start ultralyd systemet i henhold til produsentens anvisning Vevo 770, Visualsonics). Fyll riktig probe (alder E18 - P7 = 708 modell, alder> P7 = modell 707B) med destillert vann og koble til ultralyd systemet. Plasser sonden i den justerbare stand på omtrentlig orientering nødvendig for å oppnå en LV lang akse visning for en mus montert på bildebehandling plattformen slik at LV apex peker mot injeksjon arm.
2. Trykket Systemet består av en væskefylt trykkgiver, bro forsterker, datainnsamling og data innspillingen programvare (LabChart). Tilkoblingene består av tre-veis stoppekraner, slange, luer låser og slange mothaker. En 20 ml sprøyte er fylt med 10% heparinisert saltvann for spyling i den ene enden. Den andre enden kobles til en nål og en 3 ml sprøyte kroppen er modifisert for bruk som en casing å holde nålen slangen i sprøyterommet armen (figur 1).
3. Monter nålen slangen og foringsrør i sprøyterommet arm av ultralyd systemet. Klem trykkgiveren i en ring stand på den omtrentlige høyden på bildebehandling plattformen. Fest en nål passer for aldersgruppen musen (alder E18 - P3 = 30G, alder> P3 = 25G) til nålen slangen. P får tett enklere, er vanskeligere å avansere gjennom brystveggen, og har en tregere responstid. Derfor er den største p som passer i LV lumen brukes for hver alder.
4. Plasser en haug av ultralyd gel på bildebehandling plattformen og nøye stille opp sonden med det justerbare stativet slik at nålen kan avanserte direkte inn i gelen under midten av bildebehandling sonden (figur 2). Nålen må være langt nok under sonden å ikke punktere sonden dekselet, men nær nok til å være innenfor sonden brennvidde dybde. Om nødvendig, kan nålen bøyes for hånd slik at den forblir i the riktig planet gjennom reiser sin.
5. Vedlikeholde justering trekke nålen og hev bildebehandling sonden å plassere en mus på bildebehandling plattformen. Skyll kanylen å eliminere enhver gel som kan ha kommet inn i tips.

2. Mus forberedelse

1. Alle metoder som er vist i denne protokollen er godkjent av det institusjonelle Animal Care og bruk komité. Anesthetize en tidsbestemt gravid mor (E18) eller neonatal mus (P1 - 20) ved kontinuerlig inhalasjon av 1,5% isofluran. Tubing kan settes inn i en standard nese kjegle for å imøtekomme den lille hodet av en tidlig neonatal mus (P1 - 15).
2. Fest musen til bildebehandling plattform av ultralyd systemet i en dorsal decubitus posisjon med LV apex pekende mot injeksjon arm. For gravide mødre, gjelder ultralyd gel til å overvåke hjerterytmen til vedlagte EKG detektoren og sett rektal termometer for tilbakemelding kontroll av kroppstemperaturen. Neonatal mus er for liten feller disse detektorene, så puls overvåkes under trykkmålinger og kroppstemperatur blir opprettholdt med en ekstern varme lampe.
3. Fjern hår fra buken av en gravid mor eller brystet av den unge mus med en Hårfjerningskrem. Neonatal mus (P1 - 10) trenger ikke noe hårfjerning.
4. For gravide mødre, skjære opp buken med dissekere saks og buede pinsetter. Externalize en livmor horn og legg på kompress fuktet med varmt saltvann. Nøye manipulere et embryo i riktig posisjon til å skaffe en parasternal lang akse utsikt over LV ved hjelp av ultralyd probe. Mål trykket i alle embryoer på denne siden før externalizing den andre livmor horn. Hold alle embryoer og magen til mor fuktig med periodisk tillegg av varm saltløsning.

3. Trykkmåling

1. Place prewarmed, avgasset ultralyd gel på embryonale eller neonatal mus. Neonatal mus som ikke har vært depilated bør ha en liten mengde av ultralyd gel gnidd på brystet før de resterende ultralyd gel brukes for å forbedre koblingen. Senk bildebehandling sonde og justere vinkelen på bildebehandling plattformen for å oppnå en optimal parasternal LV lang akse syn. Ikke justere vinkelen på sonden fordi nålen justeringen vil gå tapt.
2. Mens overvåke LV bildet på ultralyd skjermen, sakte avansere nålen til den er nær bunnen av sonden. Juster nålen og sonden posisjon, om nødvendig, for å korrigere innretting skift. Forsiktig skylle kanylen med saltvann. Start opptak trykkdata og nullstille trykktransduseren med LabChart programvaren. Svingeren driver med temperatur og posisjon, så det er viktig å nullstille det like før måling av trykk i hver mus.
3. Sakte avansere nålen før det kan sees på kanten av ultralyd bildet, men ennå ikke i LV. Juster nålposisjon, om nødvendig, å gå inn i LV påapex. Juster probe posisjon, om nødvendig, for å opprettholde et klart bilde av nålen. Avansere nålen inn i LV lumen (figur 3), mens opptaket trykkdata og overvåking nålen plassering på ultralydbildet. Starten på pulsatile opptak fra trykktransduseren bekrefter plasseringen inne i LV lumen (figur 4).
4. Hvis nålen ser ut til å være i LV lumen, men trykket opptakene er ikke pulsatile, flush med en lys trykk på sprøytestempelet, like før en trykkøkning oppdages (ca. 5-10 mL volum). Dette bør fjerne eventuelle tresko som kan hindre en nøyaktig lesing. Hvis trykkavlesninger er fortsatt ikke pulsatile, kan nålen være over eller under den riktige flyet og ikke settes inn i LV lumen. Trekk nålen, skyll med saltvann, og forhånd igjen. Hvis pulsatile målinger er fortsatt ikke oppnås, gå videre til neste mus. Bruk en ny nål til hver mus.
5. Vellykkede trykkavlesninger kan fås fra 75% avde embryonale og neonatal mus forsøkt. Readings bør ta 5 - 10 minutter hver, og trykket data for en mus bør ikke inkluderes hvis hjertet priser er vesentlig annerledes enn forventet (figur 5A). Hjertefrekvensen har en betydelig effekt på kardiovaskulære tiltak og endrede hjerte priser er veiledende for hjertestans nød. Embryonale nød oppstår vanligvis 1 - 1,5 timer etter første eksternalisering av livmoren, er så hastighet viktig for å måle presset i en hel kull.

4. Representative Resultater

Alle resultater er oppgitt er for C57BL6J mus. Et bilde av nålen i LV lumen for en P1 mus i vist i figur 3. Nålen er nødvendig for å punktere brystveggen og få tilgang til den lille LV lumen, men det signifikant øker responstiden trykket systemet. Når en omtrentlig skritt økning i trykket er manuelt brukes på systemet, er det tid for å nå 67% av maksimalt trykk 0,067 sec med slangen bare (mest sannsynlig et tegn på den virkelige tid til å anvende trykket trinn), 0.105 sek med en 25 G nål og 0.529 sek med en 30 G nål. Forsinkelsen i å nå maksimale trykket kan sees i de komplette tracings vist i Figur 4A og 4C. Selv om responstiden er tregere med 30G nål, er bølgeformen bedre fanget på embryonale og tidlig neonatal etapper, fordi pulsen øker med alderen hos mus ^5. Til tross for denne begrensningen, kan det systoliske trykket beregnes under forutsetning av at den sanne LV diastolisk (minimum) trykket er null, og det systoliske (maksimalt) LV trykk er to ganger gjennomsnittet LV trykket bestemmes ut fra målingene ved steady state (Figur 4B og 4D ) ^6. Det er generelt antatt at det systoliske LV og arterielle trykket er like. De målte hjerterytme og beregnet LV press for ulike aldre mellom E18 og P14 er vist i figur 5.

Figur 1. Bilde av trykkgiver med tilhørende treveis stoppekraner, mannlige (M) og kvinnelige (F) Luer Lock koblinger, slanger mothaker, slange, sprøyter og nåler.

Figur 2. Bilde av den satt opp til å justere nålen med radiologisk probe (A). Den tenkelig plattformen er rotert slik at LV toppen av musen står overfor injeksjonen arm. Sonden er montert i den justerbare stand på omtrentlig orientering nødvendig for å oppnå en LV lang akse bilde. Nålen Slangen casing er montert i injeksjon armen. Nålen er rykket inn en haug av ultralyd gel på bildebehandling plattformen for å avgjøre riktig vinkel og vertikal og horisontal posisjon med hensyn til bildebehandling probe (B).

Figur 3. Bilde av nålen (N) avanserte gjennom brystveggen (CW) oginn i LV lumen i en P1 mus. Scale bar = 0,1 mm.

Figur 4. Eksempel pulsatile trykkavlesninger som nålen kommer inn i LV av en E18 (A) og P14 (C) mus. Det er en forsinkelse i å nå en stabil tilstand på grunn av responstiden til systemet med kanylen på. Zoom utsikt målingene ved steady state er vist i B og D. Merk at minimumskravene E18 LV presset er nær null, men den fulle bølgeform fra null til maksimalt trykk kan ikke bli registrert ved høyere puls av P14 mus. De gjennomsnittlige presset måles fra steady state målingene og det antas at LV systoliske trykket = 2 x målt bety press.

Figur 5 Målte hjerterytme (A) og beregnede systoliske LV trykk (B) for E18 -. P14 mus. N = 7 for E18, 5 for P1, 22 for P3, 23 for P7 og 16 for P14

Discussion

Protokollen presenteres her gir en metode for måling av LV press i slutten av embryonale og tidlige neonatale mus. Den viktigste begrensning av denne protokollen er den temporale oppløsningen av presset systemet. Trykket signalet er dempet som det reiser fra LV gjennom nålen til svingeren, og bare bety trykkverdier kan registreres. De demping kan minimeres ved å bruke den største nålen mulig, men nålen må passe innenfor LV lumen for ulike alderen mus. Fordi det diastoliske trykket kan tilnærmes som null, kan det LV og dermed arteriell systoliske trykket beregnes fra gjennomsnittlig LV trykkmålinger. Selv om flere arterielle variabler ville være ideelt (dvs. pulstrykk), gir det systoliske trykket verdifull informasjon om de kreftene i hjerte og kardiovaskulære systemet under musen utvikling. Fordelene med denne protokollen er den enkle, hastighet og repeterbarhet av målingene for høye throughput sammenligning av ulike mus genotyper eller behandlingsprotokoller. Ved å måle det systoliske trykket på kritiske utviklingsstadier, kan vi begynne å forstå samspillet mellom mekaniske krefter og den resulterende hjertestans og kardiovaskulær struktur og funksjon i menneskelig sykdom.

Solid-state katetre anses gullstandarden for trykkmålinger og har overlegen tidsmessige oppløsningen i forhold til væskefylte svingere. Standard størrelser for solid-state mus katetre er 1.0f (0,33 mm, Millar), 1.2F (0,4 mm, Scisense) eller 1.4F (0,47 mm, Millar). Vi får gode arterietrykk opplesninger i mus eldre enn P21 med 1.2F Scisense kateteret og P30 mus med 1.4F Millar kateteret. Vi har prøvd 1.0f Millar kateteret i P14 mus, men fikk ikke konsistente arterietrykk målingene. I P21 mus, sammenlignet vi våre systoliske LV trykkmålinger med arterielle press fra en 1.2F Scisense kateter. Den beregnede systolisk LV blodtrykk (67 ± 5 mmHg) for alle mus var gjennomgående lavere enn det systoliske arterietrykk (87 ± 9 mm Hg) og var svært nær gjennomsnittet arterietrykk (65 ± 8 mmHg) målt med solid-state kateter, men begge katetre identifisert betydelige forskjeller mellom genotyper ^5. Av denne grunn anbefaler vi beskrevet LV trykket metode bare for E18 til P20 mus. Trakk-plast katetre kan festes til væskefylte press transdusere og avanserte gjennom halspulsåren å få arterielle trykkmålinger ^tre. Men dette systemet fremdeles bare poster bety trykkmålinger og i våre hender var mer tidkrevende og hadde en høyere strykprosent enn LV trykkmålinger presenteres her. Servo-null trykk systemer (verden presisjonsinstrumenter) har høyere oppløsning for å måle små trykk og har bedre tidsmessig oppløsning ^4. Men servo-null-systemer krever nonconductive mikropipetter, ofte glass, for innsetting i målingen området som ikke kan avanserte gjennom brystveggen av eldre mus.

Bedøvende effekter må vurderes når ekstrapolere disse trykkmålinger å vekke mus. Det er vist at isofluran er det beste valget for å minimere kardiovaskulære effekter ¹⁰ og hvis alle mus er bedøvet med samme metode, vil sammenligninger mellom ulike grupper være gyldig. De embryonale og neonatal mus er for små for standard EKG og temperaturfølere på bildebehandling plattformen. Hjertefrekvensen må overvåkes i trykket innspillinger og ved visualisering av det bankende LV på ultralyd skjermen. Eventuelle mus som viser svært langsom puls kan være i hjertets nød og bør ikke inngå i trykket analysen. Musene må holdes varm og embryonale mus må holdes fuktig hele forsøksprotokoll. Andre etterforskere har utviklet metoder for å fordype embryoene i varme fysiologisk Saline hele bildebehandling perioden ^11, men vi har funnet ut at en varmelampe og regelmessig bruk av varmt saltvann er tilstrekkelig til å opprettholde sunne embryoer med de forventede hjerte priser under den korte eksperimentelle periode. Så lenge eksponeringen tid holdes på ca en time, har vi ikke observert betydelig variasjon mellom første og siste embryo målt, men målingene må utføres raskt for å samle data på en hel kull.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High resolution ultrasound system	VisualSonics, inc.	Vevo 770	Or other appropriate ultrasound system
High frequency ultrasound probes	VisualSonics, inc.	708 and 707B
Imaging platform and injection arm	VisualSonics, inc.	Imaging Station 2	With ECG and temperature feedback control of platform
Pressure transducer	ADInstruments	MLT 844
Bridge amplifier	ADInstruments	ML221
Data acquisition system	ADInstruments	ML866
Data recording software	ADInstruments	LabChart
Ring stand and clamp	Various		To hold pressure transducer during measurements
3-way stopcocks with luer connections, male lock	Cole-Parmer	30600-02
1/16" ID Tygon Tubing	Cole-Parmer	06408
Male and female luers w/ 1/16" hose barb	Cole-Parmer	45510-50 45510-00
24" tubing with male and female luer at each end	Cole-Parmer	30600-60
3 and 10 mL syringes	BD Biosciences
30 and 25G needles	BD Biosciences		1.5 inches in length
Big Ben manometer	Riester	1456-100
Saline	Various
Heparin	Various
Ultrasound gel	Parker Hannifin Corporation	Aquasonic 100
Hair remover lotion	Nair