Summary
Измерение давления в левом желудочке (ЛЖ) в эмбриональных и новорожденных мышей описано. Давление измеряется путем введения иглы подключены к заполненной жидкостью датчика в LV под ультразвуковым контролем. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы поддерживать нормальную функцию сердца в протоколе исследования.
Abstract
Артериальное давление значительно возрастает во время эмбрионального и постнатального развития у позвоночных животных. У мышей, кровоток первая обнаруживаются вокруг эмбриональных день (E) 8.5 1. Систолическое левого желудочка (ЛЖ) давление на 2 мм рт.ст. E9.5 и 11 мм рт.ст. в E14.5 2. На этих середине эмбриональной стадии, LV отчетливо видна через стенку грудной клетки для инвазивного измерения давления, так как ребра и кожи, не полностью разработана. Между E14.5 и родов (примерно E21) изображения методы должны быть использованы для просмотра LV. После родов, среднее артериальное давление повышается от 30 - 70 мм рт.ст. от послеродовой день (P) 2 - 35 3. Помимо P20, артериальное давление может быть измерено с твердотельными катетерами (т.е. Миллар или Scisense). Прежде, чем P20, эти катетеры являются слишком большими для развивающихся мыши артерий и артериальное давление должно быть измерено с помощью пользовательских вытащил пластиковый катетер прилагается к заполненной жидкостью датчики давления 3 или стеклянной микропипетки ATTболели в серво нулевой датчики давления 4.
Наши последние исследования показали, что наибольшее повышение артериального давления происходит в конце эмбрионального в раннем послеродовом периоде у мышей 5-7. Это большое повышение артериального давления может влиять на клетки гладкой мускулатуры (SMC) фенотип в развивающихся артерии и вызвать важные события механотрансдукции. У человека болезнь, при которой механические свойства развивающихся артерий скомпрометированы дефектов белки внеклеточного матрикса (синдром т.е. Марфана 8 и Supravalvular аортальный стеноз 9) быстрые изменения артериального давления в течение этого периода могут способствовать фенотип заболевания и тяжести через изменения в механотрансдукции сигналов. Таким образом, важно иметь возможность оценить изменения артериального давления во время конца эмбрионального и неонатального периода на мышах болезни человека.
Мы опишем метод для измерения давления LV в концеэмбриональные (E18) и раннем послеродовом (P1 - 20) мышей. Игла прикрепляется к заполненной жидкостью датчик давления вставляется в LV под ультразвуковым контролем. Принимаются меры для поддержания нормальной сердечной деятельности во время экспериментального протокола, особенно для эмбриональных мышей. Представитель данные представлены и ограничения протокола обсуждается.
Protocol
1. Ультразвук и давление в системе
- Начать ультразвуковой системы в соответствии с инструкциями производителя (Vevo 770 Visualsonics). Заполните соответствующую зонд (возраст E18 - модель P7 = 708, возраст> = P7 модели 707B) с дистиллированной водой и подключение к ультразвуковой системы. Поместите датчик в регулируемой подставкой на приблизительно ориентации, необходимых для получения Л. длинной оси зрения для мыши установлен на платформу изображения таким образом, что LV вершина указал на введение руки.
- Давление в системе состоит из заполненных жидкостью датчик давления, мост усилителя, системы сбора данных и записи данных программного обеспечения (LabChart). Соединения состоят из трех направлениях краны, трубы, замки и Luer шланг бородки. 20 мл шприц наполняется на 10% гепаринизированной солевой для промывки на одном конце. На другом конце соединяется с иглы и шприц 3 мл тела модифицированы для использования в качестве корпуса для хранения труб иглу в руку инъекцию (рис. 1).
- Установите трубку иглы и корпуса в руке инъекции ультразвуковой системы. Закрепите датчик давления в кольцевом стенде на приблизительную высоту изображения платформы. Прикрепить игла подходит для возраста мыши (возраст E18 - P3 = 30G, возраст> Р3 = 25G) с иглой трубки. Меньшие иглы забиваются проще, сложнее продвигать через стенку грудной клетки, а у более медленного времени отклика. Таким образом, крупнейший размер иглы, которая помещается в просвет LV используется для каждого возраста.
- Поместите курган ультразвука гель на изображение платформы и тщательно выстраивать зонда помощью регулируемой подставкой так, чтобы стрелка могут быть выдвинуты непосредственно в геле по центру изображения зонда (рис. 2). Игла должна быть достаточно далеко ниже зонда, чтобы не проколоть крышку датчика, но достаточно близко, чтобы быть в зонд глубины очага. При необходимости, игла может быть согнуты руки, так что он остается в гоэлектронной правильный самолет на протяжении всей своей поездки.
- Поддержание выравнивание, убрать иглу и поднять изображений зонда разместить мышь на изображение платформы. Промойте иглу, чтобы устранить любые гель, который может попасть в наконечник.
2. Мышь подготовки
- Все методы, показанные в этом протоколе были одобрены Уходу за животными и использованию комитета. Обезболить приурочен беременной матери (E18) или новорожденных мышей (P1 - 20) при непрерывном вдыхании в размере 1,5% ИФ. Трубки могут быть вставлены в стандартный конус нос для размещения небольших глава ранней неонатальной мыши (P1 - 15).
- Закрепите мыши изображение платформы ультразвуковой системы в положение лежа на спине положение LV вершиной, направленной в сторону инъекции руку. Для беременных женщин, применяют ультразвук гель для контроля частоты сердечных сокращений с прилагаемыми детектор ЭКГ и вставьте ректального термометра для управления с обратной связью по температуре тела. Новорожденных мышей слишком малы еили эти детекторы, поэтому сердечный ритм контролируется во время измерения давления и температуры тела поддерживается с внешней лампы тепло.
- Удаление волос с живота беременной женщины или грудь молодой мышь с депиляции кремом. Новорожденных мышей (P1 - 10) не требуют удаления волос.
- Для беременных женщин, вспарывали живот использованием рассечение ножницами и изогнутый пинцет. Воплощать один рога матки и место на марлю смоченную теплым физиологическим раствором. Тщательно манипулировать эмбриона в правильное положение для получения парастернальной перспективе оси LV помощью ультразвукового зонда. Измерьте давление во всех эмбрионов на этой стороне до экстернализации другие рога матки. Храните все эмбрионы и живот матери влажный с периодическим добавлением теплого физиологического раствора.
3. Измерение давления
- Место подогретую, дегазированной гель ультразвука на эмбриональной и неонатальной мыши. Новорожденных мышей, которые не были гepilated должны иметь небольшое количество геля ультразвук потер на груди до оставшихся геля ультразвук применяется для улучшения связи. Опустите изображение зонда и отрегулировать угол изображения платформу для получения оптимального парастернальной LV перспективе оси. Не регулировать угол наклона зонда, так как игла выравнивания будут потеряны.
- В то время как контроль изображения LV на УЗИ экрана, медленно продвигать иглу, пока он находится недалеко от нижней части зонда. Установите иглу и датчик положения, при необходимости, исправить согласование смены. Аккуратно промойте иглу с физиологическим раствором. Начало записи данных давления и нулю датчик давления с LabChart программного обеспечения. Преобразователь дрейфует с температурой и позиции, поэтому важно к нулю это только перед измерением давления в каждой мыши.
- Медленно продвигать иглу, пока не видно на краю ультразвуковое изображение, но еще не в LV. Отрегулируйте положение иглы, при необходимости, ввести в LVвершины. Отрегулируйте положение датчика, при необходимости, поддерживать четкое изображение иглы. Продвижение иглы в просвете LV (рис. 3), во время записи данных о давлении и мониторинга иглы место на ультразвуковом изображении. Начало пульсирующий записи из датчика давления подтверждает место внутри полости ЛЖ (рис. 4).
- Если игла оказывается в просвете LV, но давление записи не пульсирующие, на одном уровне с легким нажатием на поршень шприца, только пока повышение давления обнаружено (около 5 - 10 мкл). Это должно очистить любые сабо, которые могут затруднить точные показания. Если показания давления по-прежнему не пульсирующий, игла может быть выше или ниже плоскости правильный, а не вставляется в полость ЛЖ. Уберите иглу, промыть раствором, и заранее еще раз. Если пульсирующий показания до сих пор не получено, перейти к следующему мыши. Используйте новую иглу для каждой мыши.
- Успешное чтение давления могут быть получены из 75%эмбриональных и новорожденных мышей пытались. Чтения должны принимать 5 - 10 минут каждый и давлением данных для мыши не должны быть включены, если частота сердечных сокращений существенно отличается от ожидаемого (рис. 5а). Частота сердечных сокращений оказывает существенное влияние на сердечно-сосудистую меры и изменения частоты сердечных сокращений свидетельствует о сердечных страданий. Эмбриональные бедствия обычно происходит 1 - 1,5 часа после первого экстернализации матки, так что скорость важна для измерения давления в весь помет.
4. Представитель Результаты
Все результаты приведены для мышей C57BL6J. Образ иглы в просвете LV для P1 мыши показано на рисунке 3. Иглы необходимо прокол грудной стенки и получить доступ к небольшой LV просвет, но это значительно увеличивает время отклика давления в системе. Когда приблизительно увеличение шаг в давлении вручную применительно к системе, время до 67% от максимального давления 0,067 себес с трубкой только (скорее всего, свидетельствует о реальном времени применять давление шаг), 0,105 сек при 25 G иглу и 0,529 сек при 30 G иглу. Задержка в достижении максимального давления можно увидеть в полном обводка показано на рисунке 4А и 4С. Хотя время отклика медленнее 30G иглу, сигнал лучше, захваченных в эмбриональном и раннем неонатальном этапах, так как частота сердечных сокращений увеличивается с возрастом у мышей 5. Несмотря на это ограничение, систолическое давление может быть вычислена в предположении, что истинные диастолической (минимальное) давление равно нулю, а систолическое (максимальное) LV давление в два раза превышает среднее давление LV определяется по показаниям в стационарном состоянии (рис. 4В и 4D ) 6. Принято считать, что систолическое LV и артериального давления равны. Измеренная частота сердечных сокращений и рассчитаны LV давления для разных возрастов между E18 и P14 показано на рисунке 5.
Рисунок 1. Изображение датчика давления с прикрепленными трехходовой краны, мужчина (М) и женские (F) соединения Luer Lock, шланг бородки, трубки, шприцы и иглы.
Рисунок 2. Образ создан, чтобы выровнять иглу с датчиком изображения (A). Визуализации платформа вращается так, что LV вершине мышь перед инъекции руку. Датчик устанавливается в регулируемой подставкой на приблизительно ориентации, необходимых для получения Л. длинной оси изображения. Корпус иглы трубка устанавливается в инъекции руку. Игла продвигается в насыпь ультразвука гель на изображение, чтобы определить платформу под правильным углом и вертикальном и горизонтальном положении по отношению к изображений зонда (B).
Рисунок 3. Изображение иглой (N) прошли через стенку грудной клетки (CW) ив LV просвет в P1 мыши. Шкала бар = 0,1 мм.
Рисунок 4. Пример пульсирующего давления показания, как игла входит в РН E18 (А) и P14 (C) мыши. Существует задержка в достижении устойчивого состояния в связи с временем отклика системы с иглой прилагается. Увеличить просмотра показаний в равновесном состоянии приведены в B и D. Обратите внимание, что минимальный E18 LV давление близко к нулю, но полный сигнал от нуля до максимального давления не могут быть записаны на более высоких темпов сердце P14 мышей. Среднее давление измеряется от постоянного чтения государства и предполагается, что LV систолическое давление = 2 х измеряется среднее давление.
Рисунок 5 измерения частоты сердечных сокращений (A) и рассчитаны систолическое давление ЛЖ (B) для E18 -. P14 мышей. N = 7, E18, 5 P1, P3, 22, 23 и 16 P7 для P14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь предоставляет метод для измерения давления LV в конце эмбрионального и раннего неонатального мышей. Основным ограничением этого протокола является временным разрешением давления в системе. Давление сигнал затухает по мере продвижения от LV через иглу к датчику, и только среднее давление значения могут быть записаны. Затухание может быть сведено к минимуму с помощью крупнейшего иглы возможно, но игла должна вписываться в LV просвет для различных старых мышей. Потому что диастолическое давление может быть аппроксимирована как ноль, LV и, следовательно, артериальное систолическое давление может быть рассчитана из средней измерения давления ЛЖ. Хотя дополнительные артериальной переменных было бы идеально (т.е. импульса давления), систолическое давление дает ценную информацию о силах, действующих на сердце и сердечно-сосудистой системы во время развития мыши. Преимущества этого протокола являются простота, скорость и повторяемость измерений высокой throughpuт сравнение различных генотипов мышей и протоколов лечения. Путем измерения систолического давления в критических стадиях развития, мы можем начать понимать взаимосвязь между механическими силами и в результате сердечных и сердечно-сосудистые структуры и функции в человеческой болезни.
Твердотельные катетеры считается золотым стандартом для измерения давления и имеют более высокий временным разрешением по сравнению с заполненными жидкостью преобразователей. Стандартные размеры для твердотельных катетеров мышки 1,0 F (0,33 мм, Миллар), 1.2F (0,4 мм, Scisense) или 1.4F (0,47 мм, Миллар). Получены хорошие показания артериального давления у мышей старше P21 с 1.2F катетер Scisense и P30 мышей с катетером 1.4F Миллар. Мы постарались 1,0 F катетер Миллар в P14 мышей, но не получил последовательного чтения артериального давления. В P21 мышей, мы сравнили наши измерения систолического давления LV артериального давления от 1.2F катетер Scisense. Расчетное систолическое LV кровидавления (67 ± 5 мм рт.ст.) для всех мышей постоянно ниже, чем систолического артериального давления (87 ± 9 мм рт.ст.) и был очень близок к среднему артериального давления (65 ± 8 мм рт.ст.), измеренных с твердотельным катетер, но и катетеры было указано на существенные различия между генотипами 5. По этой причине, мы рекомендуем описано LV давление метод только для E18 на P20 мышей. Тянут-пластиковый катетер можно прикрепить к заполненной жидкостью датчики давления и прошли через сонную артерию, чтобы получить артериального измерения давления 3. Но эта система еще только записи означает, измерения давления и в наших руках было больше времени и имели более высокий процент неудач, чем измерение давления LV, представленные здесь. Servo-нуль давление системы (инструменты Всемирного Precision), имеют более высокое разрешение для измерения малых давлений и лучше временное разрешение 4. Тем не менее, серво-системы требуют нулевой непроводящих микропипетки, как правило, GLзадница, для вставки в месте измерений, которые не могут быть выдвинуты через стенку грудной клетки старых мышей.
Анестезиологическое эффекты необходимо учитывать при экстраполяции этих измерений давления пробудить мышей. Было показано, что ИФ является лучшим выбором для уменьшения сердечно-сосудистых эффектов 10 и, если все мышей под наркозом с тем же методом сравнения между различными группами будут действительны. Эмбриональных и новорожденных мышей слишком малы для стандартной ЭКГ и температурных датчиков изображения на платформу. Частота сердечных сокращений должна контролироваться в давлении записи и визуализации избиение LV на ультразвуковом экране. Любой мышей, которые показывают очень медленными темпами сердце может быть сердечный бедствия и не должны быть включены в анализ давления. Мышей должна быть теплой и эмбриональных мышей должна быть влажной всей протоколе исследования. Другие исследователи разработали методы, чтобы погрузиться в теплую эмбрионов физиологических СалинE в течение всего периода изображений 11, но мы обнаружили, что лампы тепло-и регулярное применение теплой солевой достаточно, чтобы поддерживать здоровые эмбрионы с ожидаемой частоты сердечных сокращений во время краткого экспериментального периода времени. До тех пор, как время экспозиции сохраняется примерно один час, мы не наблюдали значительную вариабельность между первым и последним эмбриона измеряли, но измерения должны быть проведены быстро, чтобы собрать данные на весь помет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась, в частности, путем грантов NIH HL087653 и HL105314. Некоторые из этих методов были разработаны в лаборатории д-ра Роберта Mecham в Вашингтонском университете в Школе медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High resolution ultrasound system | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | Or other appropriate ultrasound system |
| High frequency ultrasound probes | VisualSonics, inc. | 708 and 707B | |
| Imaging platform and injection arm | VisualSonics, inc. | Imaging Station 2 | With ECG and temperature feedback control of platform |
| Pressure transducer | ADInstruments | MLT 844 | |
| Bridge amplifier | ADInstruments | ML221 | |
| Data acquisition system | ADInstruments | ML866 | |
| Data recording software | ADInstruments | LabChart | |
| Ring stand and clamp | Various | To hold pressure transducer during measurements | |
| 3-way stopcocks with luer connections, male lock | Cole-Parmer | 30600-02 | |
| 1/16" ID Tygon Tubing | Cole-Parmer | 06408 | |
| Male and female luers w/ 1/16" hose barb | Cole-Parmer | 45510-50 45510-00 | |
| 24" tubing with male and female luer at each end | Cole-Parmer | 30600-60 | |
| 3 and 10 mL syringes | BD Biosciences | ||
| 30 and 25G needles | BD Biosciences | 1.5 inches in length | |
| Big Ben manometer | Riester | 1456-100 | |
| Saline | Various | ||
| Heparin | Various | ||
| Ultrasound gel | Parker Hannifin Corporation | Aquasonic 100 | |
| Hair remover lotion | Nair |
References
- Ji, R. P. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S. Developmental changes in ventricular diastolic function correlate with changes in ventricular myoarchitecture in normal mouse embryos. Circ. Res. 93 (9), 857-865 (2003).
- Huang, Y., Guo, X., Kassab, G. S. Axial nonuniformity of geometric and mechanical properties of mouse aorta is increased during postnatal growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290 (2), H657-H664 (2006).
- Ishii, T., Kuwaki, T., Masuda, Y., Fukuda, Y. Postnatal development of blood pressure and baroreflex in mice. Auton. Neurosci. 94 (1-2), 34-41 (2001).
- Le, V. P., Knutsen, R. H., Mecham, R. P., Wagenseil, J. E. Decreased aortic diameter and compliance precedes blood pressure increases in postnatal development of elastin-insufficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2011).
- Wagenseil, J. E. Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice. Circ. Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).
- Wagenseil, J. E. The importance of elastin to aortic development in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (2), H257-H264 (2010).
- Ramirez, F., Sakai, L. Y., Rifkin, D. B., Dietz, H. C. Extracellular microfibrils in development and disease. Cell. Mol. Life Sci. 64 (18), 2437-2446 (2007).
- Li, D. Y. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum. Mol. Genet. 6 (7), 1021-1028 (1997).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60 (1), 14-21 (2006).
