Summary
Mätning vänster kammare tryck (LV) i embryonala och neonatala möss beskrivs. Trycket mäts genom att sätta in en nål ansluten till en vätskefylld omvandlaren in i LV enligt ultraljud. Försiktighet måste vidtas för att upprätthålla en normal hjärtfunktion under det experimentella protokollet.
Abstract
Blodtrycket ökar kraftigt under embryonal och postnatal utveckling i ryggradsdjur. I mus är blodflödet första detekterbara runt embryonal dag (E) 8,5 1. Systoliskt vänster kammare (LV) tryck är 2 mmHg vid E9.5 och 11 mmHg vid E14.5 2. Vid dessa i mitten av embryonala stadier, är LV tydligt genom bröstväggen för invasiva tryckmätningar eftersom revbenen och huden inte är fullt utvecklade. Mellan E14.5 och förlossning (ca E21) avbildande metoder måste användas för att visa LV. Efter födseln, arteriella trycket ökar från 30 - 70 mmHg från postnatal dag (P) 2 - 35 3. Utöver P20 kan artärtryck mätas med solid-state katetrar (dvs. Millar och Scisense). Innan P20, dessa katetrar är för stora för att utveckla mus artärer och arteriellt tryck måste mätas med anpassade dras plastkatetrar knutna till vätskefyllda tryckgivare 3 eller glas mikropipetter AtTvärkte att servo null tryckomvandlare 4.
Vårt senaste arbete har visat att den största ökningen av blodtrycket sker under slutet av embryonal till tidig postnatal period i möss 5-7. Denna stora ökning av blodtrycket kan påverka glatta muskelceller (SMC) fenotyp i utvecklingsländer artärer och utlösa viktiga mechanotransduction händelser. I human sjukdom, där de mekaniska egenskaperna hos utvecklingsländernas artärer äventyras av brister i extracellulära matrix proteiner (dvs. Marfans syndrom 8 och supravalvulär Aortastenos 9) de snabba förändringarna i blodtrycket under denna period kan bidra till sjukdom fenotyp och svårighetsgrad genom förändringar i mechanotransduction signaler. Därför är det viktigt att kunna mäta förändringar i blodtrycket under sena embryonala och neonatala perioder musmodeller för mänsklig sjukdom.
Vi beskriver ett förfarande för mätning LV tryck i slutetembryonal (E18) och tidiga postnatala (P1 - 20) möss. En nål fäst till en vätskefylld tryckomvandlare är införd i LV enligt ultraljud. Man ser till att upprätthålla en normal hjärtfunktion under det experimentella protokollet, särskilt för de embryonala möss. Representativa data presenteras och begränsningar av protokollet diskuteras.
Protocol
1. Ultraljud och tryck systemet
- Starta ultraljudssystemet enligt tillverkarens instruktioner (VEVO 770, Visualsonics). Fyll lämplig sond (ålder E18 - P7 = modell 708, ålder> P7 = modell 707B) med destillerat vatten och ansluta till ultraljud systemet. Placera sonden i den justerbara monter på den ungefärliga riktningen krävs för att få en LV länge axeln vy för en mus monterad på imaging-plattformen så att LV spetsen pekar mot injektionen armen.
- Trycket systemet består av en vätskefylld tryckomvandlare, bryggförstärkare, datainsamlingssystem och datainsamling mjukvara (LabChart). Anslutningarna består av tre-vägs kranar, slangar, luer lås och hullingar slang. En 20 ml spruta fylls med 10% hepariniserad saltlösning för att spola vid en ände. Den andra änden ansluts till en nål och en 3 ml spruta kropp är modifierad för användning som ett hölje för att hålla nålen slangen i injektion armen (fig 1).
- Montera nålen rör och hölje i injektion armen av ultraljudssystemet. Kläm tryckgivaren i en ring monter på den ungefärliga höjden av avbildning plattformen. Sätt en nål lämplig för ålder mus (ålder E18 - P3 = 30G, ålder> P3 = 25G) till nålen slangen. Mindre nålar blir igensatt lättare, är svårare att avancera genom bröstkorgen och har en långsammare svarstid. Därför är den största nålen storlek som passar i LV lumen för varje ålder.
- Placera en hög av ultraljud gel på den bildgivande plattformen och noggrant linjera sonden med hjälp av justerbara stativet så att nålen kan föras fram direkt in i gelén under mitten av avbildningssonden (figur 2). Nålen måste vara tillräckligt långt under sonden att inte punktera sondskyddet, men nära nog för att vara inom sonden skärpedjup. Vid behov kan nålen böjas för hand så att det förblir i the korrekt plan under hela sin resa.
- Att upprätthålla inriktning, dra nålen och höja avbildningssonden att placera en mus på avbildning plattformen. Spola nålen för att eliminera eventuella gel som kan ha kommit in i spetsen.
2. Mus beredning
- Alla metoder som visas i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee. Bedöva en tidsinställd gravida mamma (E18) eller neonatal mus (P1 - 20) genom kontinuerlig inandning av 1,5% isofluran. Slang kan införas i en vanlig noskonen för att inrymma litet huvud av en tidiga neonatala möss (P1 - 15).
- Fästa mus till den bildgivande plattformen av ultraljudssystemet i en dorsal dekubitus position med LV spets pekande mot injektionen armen. För gravida kvinnor, applicera ultraljud gel på pulsmätaren med den bifogade EKG detektorn och sätt den rektala termometern för återkoppling reglering av kroppstemperaturen. Neonatala möss är alltför litet feller dessa detektorer, så hjärtfrekvens övervakas under tryckmätningarna och kroppstemperatur upprätthålls med en extern värmelampa.
- Bort hår från buken av den gravida modern eller bröstet av de unga musen med en hårborttagningskräm. Neonatala möss (P1 - 10) kräver inte någon hårborttagning.
- För gravida kvinnor, klipp upp buken med hjälp dissekera sax och böjda pincett. YTTRE en livmoder horn och plats på gasväv som fuktats med varmt saltlösning. Försiktigt manipulera ett embryo i rätt läge för att få en parasternal längdaxel bild av LV med ultraljudssonden. Mätning av trycket i alla embryon på denna sida före externalisera den andra livmoderhornet. Håll alla embryon och buk modern fuktigt med periodisk tillsats av varm saltlösning.
3. Tryckmätning
- Placera förvärmd, avgasat ultraljudsgel på embryonala eller neonatal mus. Neonatala möss som inte har depilated bör ha en liten mängd ultraljudsgel gnuggas på bröstet innan den återstående ultraljudsgel appliceras för att förbättra kopplingen. Sänk avbildningssonden och justera vinkeln på avbildning plattform för att uppnå en optimal parasternal LV längdaxel perspektiv. Justera inte vinkel av sonden, eftersom nålen anpassningen kommer att förloras.
- Under övervakning av LV bilden på skärmen ultraljud, långsamt föra nålen tills den är nära bottnen av sonden. Justera nålen och sonden position, om nödvändigt, för att korrekt inriktning skift. Försiktigt spola nålen med saltlösning. Starta registrering av tryck-och noll tryckgivaren med LabChart programvaran. Givaren driver med temperatur och position, så det är viktigt att noll den precis innan du mäter trycket i varje mus.
- Sakta framåt nålen tills den kan ses på kanten av ultraljudsbilden, men ännu inte i LV. Justera nålens position, om nödvändigt, att gå in i LV påspetsen. Justera proben position, om nödvändigt, för att upprätthålla en tydlig bild av nålen. För fram nålen i LV lumen (Figur 3), medan du spelar in tryckdata och övervakning nålen plats på ultraljudsbilden. Starten av pulserande inspelningar från tryckomvandlaren bekräftar den plats inuti LV lumen (fig 4).
- Om nålen verkar vara i LV lumen, men trycket inspelningar är inte pulserande, i jämnhöjd med ett lätt slag på sprutans kolv, bara tills en tryckökning detekteras (ca 5 till 10 | il volym). Detta bör ta bort de träskor som kan hindra en korrekt behandling. Om tryckavläsningarna är fortfarande inte pulserande kan nålen vara över eller under den korrekta planet och inte föras in i LV-lumen. Dra tillbaka nålen, spola med saltlösning, och förskott igen. Om pulserande avläsningar fortfarande inte fått, gå vidare till nästa musen. Använd en ny kanyl för varje mus.
- Framgångsrika tryckavläsningarna kan erhållas från 75% avDe embryonala och neonatala möss försökts. Avläsningar bör ta 5 - 10 minuter vardera och data tryck för en mus bör inte inkluderas om hjärtat är avsevärt annorlunda än den förväntade (figur 5A). Puls har en betydande effekt på hjärt-åtgärder och förändrade hjärtfrekvens tyder på hjärt nöd. Embryonal obehag uppstår vanligtvis 1 - 1,5 timmar efter första utläggning av livmodern, så hastigheten viktig för att mäta tryck i en hel kull.
4. Representativa resultat
Alla visade resultaten är för C57BL6J-möss. En bild av kanylen i LV lumenen för en P1 mus i figur 3. Nålen är nödvändig för att punktera bröstväggen och få tillgång till den lilla LV lumen, men det signifikant ökar svarstiden hos trycksystemet. När en ungefärlig steg tryckökning manuellt anbringas på systemet, är tiden för att nå 67% av det maximala trycket 0,067 sigc med slangen bara (mest sannolikt tecken på den verkliga tid att applicera trycket steg), 0,105 sek med en 25 G nål och 0,529 sek med en 30 G nål. Fördröjningen att uppnå maximalt tryck kan ses i de fullständiga kurvor som visas i figur 4A och 4C. Trots att svarstiden är långsammare med 30G nålen är vågformen bättre fångas på embryonala och tidig neonatala steg, eftersom hjärtfrekvensen ökar med åldern hos möss 5. Trots denna begränsning kan det systoliska trycket beräknas under antagande att den sanna LV diastoliska (minimum) trycket är noll, och det systoliska (högsta) LV tryck är två gånger den genomsnittliga LV tryck bestäms från de avläsningar vid steady state (figur 4B och 4D ) 6. Det antas allmänt att det systoliska LV och arteriella trycket är lika. De uppmätta hjärtfrekvens och beräknade LV tryck för olika åldrar mellan E18 och P14 visas i figur 5.
Figur 1. Bild av tryckgivare med bifogade tre-vägs kranar, män (M) och kvinnor (F) luer anslutningar lås, hullingar slang, slangar, sprutor och nål.
Figur 2. Bild av inrättat att rikta nålen med avbildningssonden (A). Det bildgivande plattformen vrids så att den LV spets mus är vänd mot injektionen armen. Sonden är monterad i den justerbara monter på den ungefärliga riktningen krävs för att få en LV lång axeln bild. Nålen rör höljet är monterat till insprutnings armen. Nålen förs in en hög av ultraljud gel på den bildgivande plattformen för att bestämma den korrekta vinkeln och den vertikala och horisontella läge relativt avbildningssonden (B).
Figur 3. Bild av nålen (N) fram genom bröstväggen (CW) ochi LV lumen i en P1 mus. Skalstreck = 0,1 mm.
Figur 4. Exempel pulserande tryckvärden som nålen förs in i LV för en E18 (A) och P14 (C) mus. Det finns en fördröjning i att nå ett stationärt tillstånd på grund av den svarstid hos systemet med nålen fastsatt. Zoom utsikt avläsningarna vid steady state visas i B och D. Observera att minsta E18 LV tryck är nära noll, men hela vågformen från noll till det maximala trycket kan inte spelas in på högre hjärtfrekvens P14 möss. De genomsnittliga tryck mätt från steady state värden och det antas att systolisk tryck = 2 x uppmätt betyder tryck.
Figur 5 Uppmätta hjärtfrekvens (A) och beräknade systoliska LV tryck (B) för E18 -. P14 möss. N = 7 för E18, 5 för P1, 22 för P3, 23 för P7 och 16 för P14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här ger en metod för mätning av LV-tryck i sen embryo och tidiga neonatala möss. Den största begränsningen av detta protokoll är den temporala upplösningen av trycket systemet. Trycksignalen dämpas när den färdas från LV genom nålen till omvandlaren, och endast betyda tryckvärden kan registreras. Dämpningen kan minimeras genom att använda största nålen möjligt, men nålen måste passa inom LV lumen för olika åldrade möss. Eftersom det diastoliska trycket kan approximeras som noll, kan LV och därmed arteriell systoliska trycket beräknas från de genomsnittliga LV tryckmätningar. Trots att ytterligare arteriella variabler skulle vara perfekt (dvs puls tryck) ger det systoliska trycket värdefull information om de krafter som utövas på hjärt-och hjärt-kärlsystemet under musen utveckling. Fördelarna med detta protokoll är den lätthet, snabbhet och repeterbarhet av mätningarna för hög throughput jämförelse av olika mus genotyper eller protokoll behandling. Genom att mäta det systoliska trycket vid de kritiska utvecklingsstadier, kan vi börja förstå samspelet mellan mekaniska krafter och den resulterande hjärt-och hjärt-struktur och funktion i mänskliga sjukdomar.
SSD-katetrar anses den gyllene standarden för tryckmätningar och har överlägsen temporal upplösning jämfört med vätskefyllda omvandlare. Standardstorlekarna för solid-state mus katetrar är 1.0F (0,33 mm, Millar), 1.2F (0,4 mm, Scisense) eller 1.4F (0,47 mm, Millar). Vi får bra arteriella tryckavläsningarna på möss äldre än P21 med 1.2F Scisense katetern och P30 möss med 1.4F Millar katetern. Vi har provat 1.0F Millar katetern i P14 möss, men fick inte konsekventa arteriella trycket avläsningar. I P21 möss jämförde vi våra systoliska LV tryckmätningar med arteriella trycket från en 1.2F Scisense kateter. Den beräknade systoliska LV blodtryck (67 ± 5 mmHg) för alla möss var genomgående lägre än den systoliskt artärtryck (87 ± 9 mm Hg) och var mycket nära det arteriella medeltrycket (65 ± 8 mm Hg) mätt med den fast beskaffade kateter, men båda katetrarna identifierade betydande skillnader mellan genotyper 5. Av denna anledning rekommenderar vi den beskrivna LV trycket metoden bara för E18 till P20 möss. Drog-plastkatetrar kan fästas vätskefyllda tryckomvandlare och framflyttas genom karotidartären för att erhålla arteriella tryckmätningar 3. Men detta system fortfarande bara poster innebär tryckmätningar och våra händer var mer tidskrävande och hade en högre felfrekvens än de LV tryckmätningar presenteras här. Servo-null trycksystem (World Precision Instruments) har högre upplösning för att mäta små tryck och har bättre tidsupplösning 4. Men, servo-noll kräver oledande mikropipetter, oftast glåsna, för insättning i mätstället som inte kan föras fram genom bröstväggen äldre möss.
Anestetiska effekter måste beaktas när extrapolera dessa tryckmätningar att vakna möss. Det har visat sig att isofluran är det bästa valet för att minimera kardiovaskulära effekter 10 och om alla möss bedövas med samma metod, kommer jämförelser mellan olika grupper vara giltig. De embryonala och neonatala möss är för små för standard EKG och temperatursonder på avbildning plattformen. Pulsen måste kontrolleras i tryck inspelningarna och visualisering av slå LV på ultraljud skärmen. Alla möss som visar mycket långsam hjärtfrekvens kan vara i hjärt nöd och bör inte ingå i trycket analysen. Mössen måste hållas varmt och embryonala möss måste hållas fuktig hela det experimentella protokollet. Andra forskare har utformat metoder för att fördjupa de embryon i varmt fysiologisk Saline hela avbildning perioden 11, men vi har funnit att en värmelampa och regelbunden applicering av varm saltlösning är tillräckliga för att bevara friska embryon med förväntade hjärtfrekvens under den korta experimentella tidsperioden. Så länge exponeringstid hålls till cirka en timme, har vi observerat inte signifikant variation mellan uppmätt första och sista embryo, men mätningarna måste göras snabbt för att samla in uppgifter om en hel kull.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras delvis av NIH bidrag HL087653 och HL105314. Några av de metoder som utvecklades i laboratoriet av Dr Robert Mecham vid Washington University School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High resolution ultrasound system | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | Or other appropriate ultrasound system |
| High frequency ultrasound probes | VisualSonics, inc. | 708 and 707B | |
| Imaging platform and injection arm | VisualSonics, inc. | Imaging Station 2 | With ECG and temperature feedback control of platform |
| Pressure transducer | ADInstruments | MLT 844 | |
| Bridge amplifier | ADInstruments | ML221 | |
| Data acquisition system | ADInstruments | ML866 | |
| Data recording software | ADInstruments | LabChart | |
| Ring stand and clamp | Various | To hold pressure transducer during measurements | |
| 3-way stopcocks with luer connections, male lock | Cole-Parmer | 30600-02 | |
| 1/16" ID Tygon Tubing | Cole-Parmer | 06408 | |
| Male and female luers w/ 1/16" hose barb | Cole-Parmer | 45510-50 45510-00 | |
| 24" tubing with male and female luer at each end | Cole-Parmer | 30600-60 | |
| 3 and 10 mL syringes | BD Biosciences | ||
| 30 and 25G needles | BD Biosciences | 1.5 inches in length | |
| Big Ben manometer | Riester | 1456-100 | |
| Saline | Various | ||
| Heparin | Various | ||
| Ultrasound gel | Parker Hannifin Corporation | Aquasonic 100 | |
| Hair remover lotion | Nair |
References
- Ji, R. P. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S. Developmental changes in ventricular diastolic function correlate with changes in ventricular myoarchitecture in normal mouse embryos. Circ. Res. 93 (9), 857-865 (2003).
- Huang, Y., Guo, X., Kassab, G. S. Axial nonuniformity of geometric and mechanical properties of mouse aorta is increased during postnatal growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290 (2), H657-H664 (2006).
- Ishii, T., Kuwaki, T., Masuda, Y., Fukuda, Y. Postnatal development of blood pressure and baroreflex in mice. Auton. Neurosci. 94 (1-2), 34-41 (2001).
- Le, V. P., Knutsen, R. H., Mecham, R. P., Wagenseil, J. E. Decreased aortic diameter and compliance precedes blood pressure increases in postnatal development of elastin-insufficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2011).
- Wagenseil, J. E. Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice. Circ. Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).
- Wagenseil, J. E. The importance of elastin to aortic development in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (2), H257-H264 (2010).
- Ramirez, F., Sakai, L. Y., Rifkin, D. B., Dietz, H. C. Extracellular microfibrils in development and disease. Cell. Mol. Life Sci. 64 (18), 2437-2446 (2007).
- Li, D. Y. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum. Mol. Genet. 6 (7), 1021-1028 (1997).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60 (1), 14-21 (2006).
