Medición de la presión del ventrículo izquierdo a finales de embriones de ratones y Neonatal

Summary

Medición de la presión del ventrículo izquierdo (VI) en embriones de ratones y neonatal se describe. La presión se mide mediante la inserción de una aguja conectada a un transductor lleno de líquido en el ventrículo izquierdo bajo la guía del ultrasonido. Se debe tener cuidado para mantener la función cardiaca normal durante el protocolo experimental.

Abstract

La presión arterial aumenta de forma significativa durante el desarrollo embrionario y postnatal en animales vertebrados. En el ratón, el flujo sanguíneo es detectable primero alrededor del día embrionario (E) 8,5 ^1. Sistólica del ventrículo izquierdo (VI) la presión es de 2 mmHg en E9.5 y E14.5 11 mmHg en ^dos. En estas etapas mediados de los embriones, el VI es claramente visible a través de la pared torácica para la medición de presión invasiva, porque las costillas y la piel no están completamente desarrollados. Entre E14.5 y el parto (aproximadamente E21) los métodos de imagen debe ser usado para ver el VI. Después del nacimiento, la media de aumento de la presión arterial de 30 a 70 mmHg desde el primer día postnatal (P) 2 - 35 ^3. Más allá de P20, la presión arterial se puede medir con catéteres de estado sólido (es decir, Millar o Scisense). Antes de P20, estos catéteres son demasiado grandes para el desarrollo de las arterias de ratones y la presión arterial debe ser medida con la costumbre sacó catéteres de plástico unidos a transductores de presión llenas de líquido o de vidrio ³ micropipetas attardía en deseos de servo transductores de presión nula ^4.

Nuestro trabajo reciente ha demostrado que el mayor aumento de la presión arterial se produce durante los fines de embriones con el período postnatal temprano en ratones ^{de 5-7.} Este gran aumento de la presión arterial puede influir en las células musculares lisas (SMC) fenotipo en las arterias en desarrollo y desencadenar eventos importantes mecanotransducción. En la enfermedad humana, donde las propiedades mecánicas de las arterias en desarrollo se ven comprometidos por defectos en las proteínas de la matriz extracelular (Síndrome de esto es de Marfan ⁸ y estenosis aórtica supravalvular ⁹⁾ los rápidos cambios en la presión arterial durante este período puede contribuir a fenotipo de la enfermedad y la gravedad a través de alteraciones en mecanotransducción señales. Por lo tanto, es importante ser capaz de medir los cambios de presión sanguínea durante embrionario finales y los períodos neonatales en modelos de ratón de la enfermedad humana.

Se describe un método para medir la presión del VI a finales deembrionario (E18) y postnatal (P1 - 20) ratones. Una aguja conectada a un transductor de presión llena de líquido se introduce en el ventrículo izquierdo bajo guía ecográfica. Hay que tener cuidado para mantener la función cardiaca normal durante el protocolo experimental, sobre todo para los embriones de ratones. Los datos representativos se presentan y las limitaciones del protocolo se discuten.

Protocol

1. La ecografía y la presión del sistema

1. Inicie el sistema de ultrasonido de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Vevo 770, Visualsonics). Llene la sonda apropiada (años de edad E18 - P7 = modelo 708, edad> = P7 modelo 707B) con agua destilada y conectar con el sistema de ultrasonido. Coloque la sonda en el soporte ajustable a la orientación aproximada necesaria para obtener un LV en el eje largo de un ratón montado en la plataforma de imágenes para que el ápex del VI es apuntada hacia el brazo de la inyección.
2. El sistema de presión consiste en un transductor de presión llena de líquido, un amplificador de puente, el sistema de adquisición de datos y software de grabación de datos (LabChart). Las conexiones consisten en llaves de paso de tres vías, tubos, cerraduras Luer y para tubos. Una jeringa de 20 ml se llenó con 10% de solución salina heparinizada para el lavado en un extremo. El otro extremo se conecta a una aguja y un cuerpo de jeringa de 3 ml se modificó para su uso como una envoltura para mantener el tubo de la aguja en el brazo de la inyección (Figura 1).
3. Montar el tubo de la aguja y la carcasa en el brazo de inyección del sistema de ultrasonidos. Fijar el transductor de presión en un soporte de anillo a la altura aproximada de la plataforma de imágenes. Colocar una aguja apropiada para la edad del ratón (edad E18 - P3 = 30G, edad> = 25G P3) al tubo de la aguja. Agujas más pequeñas se obstruyen más fácil, son más difíciles de avanzar a través de la pared torácica, y tienen un tiempo de respuesta más lento. Por lo tanto, el mayor tamaño de aguja que se ajusta en el lumen del VI se utiliza para cada edad.
4. Colocar un montículo de gel de ultrasonido en la plataforma de formación de imágenes y cuidadosamente alinear la sonda usando el soporte ajustable de modo que la aguja se puede avanzar directamente en el gel bajo el centro de la sonda de imagen (Figura 2). La aguja debe ser lo suficientemente debajo de la sonda para no romper la cubierta de la sonda, pero lo suficientemente cerca como para estar dentro de la profundidad de la sonda de coordinación. Si es necesario, la aguja puede ser doblada por la mano de modo que permanece en ªe plano correcto a lo largo de su recorrido.
5. El mantenimiento de la alineación, retraer la aguja y elevar la sonda de imagen para colocar un cursor sobre la plataforma de formación de imágenes. Lavar la aguja para eliminar cualquier gel que puede haber entrado en la punta.

2. Ratón de preparación

1. Todos los métodos que se muestran en este protocolo ha sido aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo. Anestesie una madre embarazada cronometrado (E18) o el ratón recién nacido (P1 - 20) por inhalación continua de isoflurano del 1,5%. Tubería puede ser insertado en un cono de nariz estándar para acomodar la cabeza pequeña de un ratón neonatal temprana (P1 - 15).
2. Asegure el ratón a la plataforma de imágenes del sistema de ultrasonidos en una posición de decúbito dorsal, con el ápex del VI apuntando hacia el brazo de la inyección. Para las madres embarazadas, aplicar gel para ultrasonidos para monitorizar la frecuencia cardíaca con el adjunto detector de ECG e inserte el termómetro rectal para el control de retroalimentación de la temperatura del cuerpo. Ratones recién nacidos son muy pequeños fo estos detectores, por lo que el ritmo cardíaco se controla durante las mediciones de presión y la temperatura corporal se mantiene con una lámpara de calor externo.
3. Retire el cabello del abdomen de la madre embarazada o en el pecho de la joven ratón con una crema depilatoria. Ratones recién nacidos (P1 - 10) no requieren ningún tipo de depilación.
4. Para las madres embarazadas, cortar y abrir el abdomen con unas tijeras y pinzas de disección curvas. Externalizar un cuerno uterino y el lugar en una gasa humedecida con solución salina caliente. Cuidadosamente manipular un embrión en la posición adecuada para obtener una vista paraesternal eje largo del VI utilizando la sonda de ultrasonido. Medir la presión en todos los embriones de este lado antes de la externalización de la trompa uterina otro. Mantenga todos los embriones y el abdomen de la madre húmedo con adición periódica de solución salina caliente.

3. Medición de presión

1. Lugar precalentado, gel de ultrasonido desgasificado del ratón embrionario o neonatal. Ratones recién nacidos que no han sido ddepilado debe tener una pequeña cantidad de gel de ultrasonido se frota sobre su pecho antes de que el gel de ultrasonido restante se aplica para mejorar el acoplamiento. Bajar la sonda de imagen y ajustar el ángulo de la plataforma de imágenes para obtener una óptima paraesternal vista LV largo del eje. No ajustar el ángulo de la sonda debido a que la alineación aguja se perderán.
2. Mientras que el control de la imagen de LV en la pantalla del ultrasonido, avanzar lentamente la aguja hasta que esté cerca de la parte inferior de la sonda. Ajustar la posición de la aguja y la sonda, si es necesario, para corregir los cambios de alineación. Lave suavemente la aguja con solución salina. Iniciar el registro de datos de presión y poner a cero el transductor de presión con el software LabChart. El transductor se desplaza con la temperatura y la posición, lo que es importante para que cero justo antes de medir la presión en cada ratón.
3. Lentamente avanzar la aguja hasta que pueda ser visto en el borde de la imagen de ultrasonidos, pero no todavía en el VI. Ajuste la posición de la aguja, si es necesario, para entrar en el ventrículo izquierdo en elápice. Ajustar la posición de la sonda, si es necesario, para mantener una imagen clara de la aguja. Avance la aguja en el lumen del VI (Figura 3), durante la grabación de los datos de presión y seguimiento de la localización de la aguja en la imagen de ultrasonido. El inicio de grabaciones pulsátiles del transductor de presión confirma la ubicación dentro del lumen del VI (Figura 4).
4. Si la aguja parece estar en el lumen del VI, pero los registros de presión no son pulsátil, a ras con un ligero golpe en el émbolo de la jeringa, sólo hasta un aumento de presión es detectado (alrededor de 5 a 10 l de volumen). Esto debería eliminar cualquier obstrucción que pueden ser evitadas con una lectura precisa. Si las lecturas de presión no son todavía pulsátil, la aguja puede estar por encima o por debajo del plano correcto y no se inserta en el lumen del VI. Retirar la aguja, lavar con solución salina, y avanzar de nuevo. Si las lecturas pulsátiles aún no se obtuvo, mueva el ratón a la próxima. Utilice una aguja nueva para cada ratón.
5. El éxito de las lecturas de presión puede obtenerse a partir de 75% delos ratones embrionarios y neonatales intentado. Las lecturas deben tomar 5 - 10 minutos cada uno y los datos de presión para un ratón no debe ser incluido si la frecuencia cardíaca son muy diferentes de lo esperado (Figura 5). La frecuencia cardíaca tiene un efecto significativo sobre las medidas cardiovasculares y las tasas de alteración del corazón son indicativos de angustia cardíaca. Malestar embrionario ocurre generalmente 1 - 1,5 horas después de la externalización primero del útero, por lo que la velocidad es importante para la medición de presiones en una camada entera.

4. Los resultados representativos

Todos los resultados mostrados son para ratones C57BL6J. Una imagen de la aguja en el lumen LV para un ratón en P1 se muestra en la Figura 3. La aguja es necesario perforar la pared del pecho y tener acceso a la pequeña luz del VI, pero aumenta significativamente el tiempo de respuesta del sistema de presión. Cuando un aumento de paso aproximada de la presión se aplica manualmente al sistema, el tiempo para alcanzar el 67% de la presión máxima es de 0.067 síc con el tubo sólo (lo más probable indicativo del tiempo real para aplicar el paso de presión), 0,105 seg con una aguja 25 G y 0,529 seg con una aguja G 30. El retraso en alcanzar la presión máxima se puede ver en los trazados completos mostrados en la Figura 4A y 4C. Aunque el tiempo de respuesta es más lenta con la aguja 30G, la forma de onda está mejor capturado en las etapas embrionarias y neonatal precoz, debido a la frecuencia cardíaca aumenta con la edad en los ratones ^5. A pesar de esta limitación, la presión sistólica puede ser calculado suponiendo que el verdadero diastólica (mínima) la presión es cero, y la presión sistólica (máxima) de presión del ventrículo izquierdo es dos veces la media de presión del VI determina a partir de las lecturas en estado estacionario (Figura 4B y 4D ) ^6. En general se supone que la sistólica y la presión arterial son iguales. Los ritmos cardíacos medidos y calculados presiones LV para varias edades entre E18 y P14 se muestran en la Figura 5.

Figura 1. Imagen del transductor de presión con los adjuntos de tres vías llaves de paso, del sexo masculino (M) y femenino (F) conexiones Luer, púas de mangueras, tubos, jeringas y agujas.

Figura 2. Imagen de la. Creado para alinear la aguja con la sonda de imagen (A) La plataforma de imágenes se hace girar de modo que el ápice del VI del ratón que se enfrenta el brazo de la inyección. La sonda está montada en el soporte ajustable en la orientación necesaria para obtener una aproximación del VI eje largo de la imagen. La carcasa tubo de la aguja está montado en el brazo de la inyección. La aguja se introduce en un montículo de gel de ultrasonido en la plataforma de formación de imágenes para determinar el ángulo correcto y la posición vertical y horizontal con respecto a la sonda de imagen (B).

Figura 3. Imagen de la aguja (N) avanza a través de la pared del pecho (CW) yen el lumen del VI en un ratón P1. Barra de escala = 0,1 mm.

Figura 4. Ejemplo de lecturas de la presión pulsátil que la aguja entra en el ventrículo izquierdo de un E18 (A) y P14 (C) del ratón. Existe un retraso en alcanzar un estado estacionario, debido al tiempo de respuesta del sistema con la aguja. Ampliación de puntos de vista de las lecturas en estado de equilibrio se muestran en la B y D. Nótese que las presiones mínimas E18 LV están cerca de cero, pero la forma de onda completa desde cero hasta la máxima presión no se puede grabar en los ritmos cardíacos más altos de p14 ratones. Las presiones medias se miden a partir de las lecturas de estado estable y se supone que la presión sistólica del VI = 2 x mide la presión media.

Figura 5 medidos frecuencia cardíaca (A) y se calcularon las presiones sistólica del VI (B) para E18 -. P14 ratones. N = 7 para E18, 5 para P1, P3 para 22, 23 para P7 y P14 16 para

Discussion

El protocolo presentado aquí proporciona un método para medir la presión del VI en embrionario finales y principios de los ratones recién nacidos. La principal limitación de este protocolo es la resolución temporal del sistema de presión. La señal de presión se amortigua a medida que viaja desde el ventrículo izquierdo a través de la aguja al transductor, y sólo los valores medios de presión se puede grabar. La amortiguación puede minimizarse mediante el uso de la aguja más grande posible, pero la aguja debe encajar dentro del lumen LV para diferentes ratones de edad. Debido a que la presión diastólica se puede aproximar a cero, la presión sistólica del VI y en consecuencia arterial puede ser calculada a partir de las mediciones de la presión media de LV. Aunque otras variables arteriales sería ideal (es decir, presión de pulso), la presión sistólica proporciona información valiosa sobre las fuerzas que actúan sobre el sistema cardiaco y cardiovascular durante el desarrollo del ratón. Los beneficios de este protocolo son la facilidad, velocidad y repetibilidad de las mediciones de alta throughpula t de comparación de los genotipos del ratón o varios protocolos de tratamiento. Mediante la medición de la presión sistólica en las fases críticas de desarrollo, podemos empezar a entender la interacción entre las fuerzas mecánicas y la estructura resultante cardíaco y cardiovascular y la función en enfermedades humanas.

De estado sólido catéteres se considera el patrón oro para las mediciones de presión y tienen una resolución temporal superior en comparación con los transductores llenas de líquido. Los tamaños estándar para catéteres de ratón de estado sólido son 1.0f (0,33 mm, Millar), 1.2f (0,4 mm, Scisense) o 1.4f (0,47 mm, Millar). Se obtienen buenas lecturas de la presión arterial en ratones mayores de P21 con el catéter Scisense 1.2f y P30 ratones con el catéter 1.4f Millar. Hemos probado el 1.0f catéter Millar en P14 ratones, pero no consiguió consistentes lecturas de presión arterial. En los ratones P21, comparamos nuestros sistólica del ventrículo izquierdo con mediciones de la presión la presión arterial de un catéter Scisense 1.2f. El valor calculado de sangre sistólica del VIpresión (67 ± 5 mmHg) para todos los ratones fue consistentemente menor que la presión arterial sistólica (87 ± 9 mmHg) y estaba muy cerca de la presión arterial media (65 ± 8 mmHg) medida con el catéter de estado sólido, pero ambos catéteres identificar diferencias significativas entre los genotipos ^5. Por esta razón, se recomienda el método descrito LV presión sólo para E18 a P20 ratones. Tirado-catéteres de plástico se puede unir a transductores de presión llenas de líquido y se hace avanzar a través de la arteria carótida para obtener mediciones de presión arterial ^3. Sin embargo, este sistema todavía sólo los registros de mediciones de la presión media y en nuestras manos estaba más tiempo y tenía una tasa de fracaso más altas que las mediciones de la presión de baja tensión que aquí se presenta. Servo-nulos los sistemas de presión (World Precision Instruments) tienen una mayor resolución para medir presiones pequeñas y tienen una resolución temporal mejor ^4. Sin embargo, servo-nulos sistemas requieren micropipetas no conductores, por lo general glculo, para su inserción en el sitio de medición que no se puede avanzar a través de la pared torácica de ratones más viejos.

Los efectos anestésicos deben ser considerados cuando se extrapolan estas mediciones de la presión a los ratones despiertos. Se ha demostrado que el isoflurano es la mejor opción para minimizar los efectos cardiovasculares ¹⁰ y si todos los ratones se anestesiaron con el mismo método, las comparaciones entre los diferentes grupos será válida. Los ratones embrionarios y neonatales son demasiado pequeñas para el estándar de ECG y sondas de temperatura en la plataforma de formación de imágenes. La frecuencia cardíaca debe ser monitoreada en los registros de presión y visualización de los golpes del VI en la pantalla del ecógrafo. Cualquier ratones que muestran ritmos cardíacos muy lentos pueden estar en peligro cardíaco y no deben ser incluidos en el análisis de la presión. Los ratones se debe mantener caliente y embriones de ratones se debe mantener húmedo durante todo el protocolo experimental. Otros investigadores han diseñado métodos para sumergir a los embriones en la salinidad fisiológica tibiae todo el período de formación de imágenes ^11, pero hemos encontrado que una lámpara de calor y la aplicación periódica de solución salina caliente son suficientes para mantener los embriones sanos con los ritmos cardíacos previstos durante el período de tiempo breve experimental. Mientras el tiempo de exposición se mantiene a aproximadamente una hora, no hemos observado una variabilidad significativa entre el embrión primero y el último medido, pero las mediciones deben realizarse rápidamente para recoger datos sobre una camada entera.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High resolution ultrasound system	VisualSonics, inc.	Vevo 770	Or other appropriate ultrasound system
High frequency ultrasound probes	VisualSonics, inc.	708 and 707B
Imaging platform and injection arm	VisualSonics, inc.	Imaging Station 2	With ECG and temperature feedback control of platform
Pressure transducer	ADInstruments	MLT 844
Bridge amplifier	ADInstruments	ML221
Data acquisition system	ADInstruments	ML866
Data recording software	ADInstruments	LabChart
Ring stand and clamp	Various		To hold pressure transducer during measurements
3-way stopcocks with luer connections, male lock	Cole-Parmer	30600-02
1/16" ID Tygon Tubing	Cole-Parmer	06408
Male and female luers w/ 1/16" hose barb	Cole-Parmer	45510-50 45510-00
24" tubing with male and female luer at each end	Cole-Parmer	30600-60
3 and 10 mL syringes	BD Biosciences
30 and 25G needles	BD Biosciences		1.5 inches in length
Big Ben manometer	Riester	1456-100
Saline	Various
Heparin	Various
Ultrasound gel	Parker Hannifin Corporation	Aquasonic 100
Hair remover lotion	Nair