Summary
Metoden beskriver den procedure, som Hawaiian stumphale blæksprutte,
Abstract
Specifikke bakterier findes i association med dyrevæv 1-5. Sådanne værts-bakterielle foreninger (symbioser) kan være skadelig (patogene), har ingen egnethed konsekvens (kommensal), eller være en fordel (mutualistisk). Mens megen opmærksomhed er blevet givet til sygdomsfremkaldende interaktioner, vides kun lidt om de processer, der dikterer den reproducerbare købet af gavnlige / kommensale bakterier fra omgivelserne. Den lys-organ mutualism mellem marine Gram-negativ bakterie V. fischeri og Hawaiian stumphale blæksprutte, E. scolopes, repræsenterer en meget specifik interaktion, hvor en vært (E. scolopes) etablerer et symbiotisk forhold med kun en bakteriearter (V. fischeri) under hele løbet af sin levetid 6,7. Bioluminescens er fremstillet af V. fischeri i denne interaktion tilvejebringer en anti-eliminerende fordel E. scolopes under natlige aktiviteter 8,9, mensdet næringsrige værtsvævet giver V. fischeri med en beskyttet niche 10. Under hver vært generation, er dette forhold gentaget, hvilket repræsenterer en forudsigelig proces, der kan vurderes i detaljer på forskellige stadier af symbiotisk udvikling. I laboratoriet, hvis opsamlet inden for de første 30-60 min og overførtes til symbiont-frit vand juvenile blæksprutte lugen aposymbiotically (uncolonized), og kan ikke blive koloniseret undtagen ved den eksperimentelle inokulum 6. Denne interaktion giver således en nyttig model system til at vurdere de enkelte trin, der fører til konkrete køb af en symbiotisk mikrobe fra miljøet 11,12.
Her beskriver vi en metode til at vurdere graden af kolonisering der opstår, når nyklækkede aposymbiotic E. scolopes udsættes for (kunstige) havvand indeholdende V. fischeri. Denne enkle analyse beskriver podning, naturlig infektion, og inddrivelseaf den bakterielle symbionten fra den spirende lys organ E. scolopes. Care er taget til at give en konsistent miljø for dyrene under symbiotisk udvikling, især med hensyn til vandkvalitet og lette signaler. Metoder til at karakterisere det symbiotiske beskrevne population omfatter (1) måling af bakterielt afledte bioluminescens, og (2) direkte koloni optælling af genvundne symbionter.
Protocol
1. Fremstillinq af bakteriel Podestoffer
- Dag 0
To dage før blæksprutte podningen, plade de relevante bakteriestammer på LBS 13 agar. - Inkuber bakterier ved 25-28 ° C natten over.
- Dag 1
Inokulere 3 ml LBS medium i et glas kultur rør med en koloni af hver V. fischeri stamme for infektion. Forbered dobbelt rør som backup. - Dag 2
(Koordiner bakterielle trin 1,4-1,6 med Squid trin 3.7-3.10)
1 time forud for inokulering, subkultur bakterier 1:80 (37,5 ul) i 3 ml LBS i et glas podningsrør og vokse i 1 time med beluftning. - Måle OD600 af prøven forud for inokulering. Typiske målinger 0,3-0,6 afhængig af stammen.
- For et mål inokulum på 3-5 x 10 3 CFU / ml beregne podevolumen på følgende måde: podevolumen (pi) = 1,25 / OD 600 (f.eks For OD600 = 0,5, den beregnede podevolumen = 1.25/0.5 = 2,5 ul). Denne mængde sættes direkte til havvandet indeholdende blæksprutte i trin 4.1. Denne beregning kan være nødvendigt at justere forskellige stammer af V. fischeri eller til podning ved lavere eller højere niveauer end dem, der er angivet her.
2. Fremstilling af agarplader til tælling af Podestoffer
- For hver behandling. Etiket LBS plader (2 per behandling) til plade prøver af inoculum i trin 4,1
- Tilsættes 5 sterile plettering perler pr plade.
3. Indsamling af Squid Juveniles
- Mål saltholdighed af Instant Ocean bruge refraktometer og juster til 35 ‰.
- Filtrere en L Instant Ocean hjælp af filtreringsenheden og et tilknyttet vakuum linje eller vakuumpumpe til frembringelse filtersteriliseret Instant Ocean (FSIO). Oxygenere vandet ved omhvirvling kraftigt før hver afgivelse. The filterenhed kan genanvendes i 2 dage.
- Portion 40-50 ml af FSIO i hver af to (2) engangs prøve skåle. Mærk et som earlies og én som timelies.
- Fremstille et overskud af plast overførselspipetter for erhvervelse juvenil blæksprutte ved skæring af pipetten 1 cm fra spidsen, over de laveste forhøjningerne (se figur 3). Dette muliggør en større område, gennem hvilket blæksprutte kan passere ved samling. Kassere overførselspipetter, hvor der er en ru blotlagt overflade.
- Ved hjælp af tilberedte overførselspipetter, E. indsamle scolopes at klækkede natten over og overføre til earlies skål FSIO. Tidlige larver har været i ægget systemet i løbet af 1 h og er modtagelige for kolonisering af kontaminerende V. fischeri i ægget systemet. Brug ikke earlies for følsomme koloniseringen eksperimenter.
- Se æg tanke hver 30-45 min nye larver. Sørg for, at alle nyfødte er ryddet i løbet af hver cHeck. Fjern hatchlings med en overførsel pipette, og indbetaler til timelies skål FSIO. Dyr, der er indsamlet i tide er til rådighed for kolonisering eksperimenter.
- Når indsamlingen er færdig (~ 45 min efter mørkets frembrud), overføre blæksprutte til hoved laboratoriet. Empirisk er det fordelagtigt at kolonisere dyrene under uafbrudte laboratorie lysforhold i 3 timer inokulationer.
- For hver behandling, udarbejder en skål med 40 ml FSIO. Tilsæt blæksprutter til skåle for analysen (maks. n = 40 per skål).
- Forbered en ekstra skål som en aposymbiotic (negativ) kontrol.
- Forbered en dedikeret overførsel pipette for hver behandling.
- Afliv ekstra blæksprutter i 2% ethanol.
4. Squid Colonization
- Dag 2 - anvendelse af en P10 Pipetman, dispensere den beregnede aliquot af bakterier (trin 1.5) i hver blæksprutte skål (trin 3.8) for hver behandling. Start en 3 timer timer umiddelbart efterden første inokulering.
- For hver behandling, skaber en "Vortex" i skålen med den dedikerede overførsel pipetten ved anbringelse af pipetten nær kanten af skålen og at pipettere op og ned gange for at blande vand og blæksprutte til omkring 10 sek. Gennemgribende blanding er kritisk.
- Plate 50 gl fra hver skål på en LBS agarplade fra Trin 2,2 (for teknisk replikater, plade to 50 gl plader per behandling). Inkuber ved 25-28 ° C natten over.
- Forberede vaskekummer (100 ml FSIO / EA) til hver behandling.
- Forberede Drosophila hætteglas (4 ml FSIO / EA) for hver blæksprutte.
- Efter præcist 3 timer, overføre blæksprutte til deres respektive servantestel (komplet til alle behandling). Dette forhindrer inokulering.
- Fortsæt til at overføre hver enkelt blæksprutte til sin egen Drosophila hætteglas med FSIO. Anvende en udpeget overførsel pipette til hver behandling.
- Bevæge bakkerne i Drosophila hætteglas til blæksprutte mulighed for at vende tilbage til den dag / nøjre lyscyklus dyrene opleves under embryogenese.
- Dag 3 - Prepare Drosophila hætteglas (4 ml FSIO / ea) for hver blæksprutte.
- Forud for solnedgang ved 22-24 timer efter inokulation, hver blæksprutte overføres til et nyt Drosophila hætteglas. Anvende en udpeget overførsel pipette til hver behandling.
- Dag 4 - Forbered mærket 1,5 ml mikrocentrifugerør (1/squid).
- Før skumringen på 46-48 timer efter podning, måle og registrere luminescens af hver blæksprutte i Drosophila hætteglasset (luminometer sæt til 6 s integration og auto-læs videre låg lukning).
- Som en negativ kontrol for baggrund luminescens, måler et hætteglas med FSIO, der ikke indeholder nogen blæksprutte.
- Overfør hver squid i et volumen på omkring 700 pi af en 1,5 ml mikrocentrifugerør fra trin 4,12. Flyt til en pap Frostboks. Når låget er placeret på boksen, skal du ikke fjerne det som de lette tidskoder for bakterier udvisning er ikke well-forstået.
- Frys mikrocentrifugerør ved -80 ° C natten over.
5. Bestemmelse af Kolonisering Niveauer
- For hver blæksprutte, forberede to (2) mikrocentrifugerør, hver med 475 ul FSIO (eller autoklaveres 70% Instant Ocean).
- Forberede pestles ved først at anvende en Kimwipe at rense støderen og fjerne grove debris og / eller væv.
- Sted pestles spids nedad i et 50 ml bægerglas indeholdende 95% ethanol. Ethanol skal tilføjes til en højde på cirka 3 cm.
- For hver støder, fjerne fra bægeret og tør spidsen med en Kimwipe.
- Dyp pistil tilbage i ethanol bad, fjerne og indsætte (spidsen op) i et mikrocentrifugerør rack og lad det lufttørre helt i ca 15 minutter.
- Tø squid i et mikrocentrifugerør tandstang (maksimum n = 8).
- Hvis det er nødvendigt, justere lydstyrken til 700 gl.
- Ved hjælp af en pistil fra trin 5,5, forstyrre dyret væv, indtil blækket sac RUPrer (vandet vil blive en mørk grå farve).
- Fjerne pistil og sikre, at alle væv forbliver i røret.
- Vortex vævet kort efter præcis 10 sekunder (brug en timer).
- Tillade vævet at hvile i 10 minutter. Vævet vil bundfælde, og bakterier og blæk forbliver i opløsning. Til beregningerne, der følger, er bakterier / blæk opløsning af [A] fortynding (dvs. E. scolopes lys organ homogenat i 700 pi). Serielle 1:20 fortyndinger ([B], [C]) er beskrevet nedenfor.
- For [B] fortynding tilsættes 25 ul [A] til en af de mikrocentrifugerør fremstillet i trin 5.1. Vortex.
- For [C] fortynding tilsættes 25 ul [B] med en af de mikrocentrifugerør fremstillet i trin 5.1. Vortex.
- Pladen 50 ul af hver fortynding på LBS agar, 2 gentagelser per behandling.
- Pladerne inkuberes ved 25-28 ° C natten over.
6. Dataanalyse
- For at beregne CFU / lys orgel (LO), landet kolonier på pladen for hver behandling, hvor 10-400 kolonier er til stede, og bruge den rigtige formel:
CFU / LO = (kolonier på [A] plade) x 14, eller
CFU / LO = (kolonier på [B] plade) x 280, eller
CFU / LO = (kolonier på [C] plade) x 5600. - Plotte individuelle datapunkter og medianer på en logaritmisk skala.
- De data er ofte ikke normalt fordelt, med forskellige varianser, og de afvigende kan indeholde biologisk meningsfuld information. Derfor ikke-parametriske test giver en nyttig metode til at bestemme, om de behandlinger signifikant forskellige.
- Brug GraphPad Prism software til statistisk analyse. For to behandlinger, anvender Wilcoxon Rank Sum-test. For sammenligninger mellem mere end to behandlinger, skal du bruge Kruskal-Wallis test med relevante post-test.
7. Repræsentative resultater
Resultaterne fra en prøve kolonisering assay er vist i figur 4. To stammer af
Figur 1. Rutediagram for kolonisering procedure. Bakterier og blæksprutter er høstet separat, og derefter blandes på den angivne inokulum. Blæksprutte vaskes derefter overført til nye vand ved 3 h, 24 h, og 4 8 timer efter inokulering. Ved 48 h luminescens måles, og dyrene er frosset, som tjener til overfladen sterilisere dyr. Lys-organ koloniseret bakterier forbliver levedygtige ved -80 ° C gennem en tø (ingen yderligere fryse-tø-cykler).
Figur 2. Rutediagram, der illustrerer homogenisering og fortynding udpladning af bakterierne. Serielle 20-fold fortyndinger give den relevante dynamiske område for tælling af koloniserede bakterier.
Figur 3. Overførselspipetter med en passende smal aksel tilspidsning en snæver boring (A), som ville beskadige juvenil blæksprutte. Forbehandling ved at afskære smalleste sektion med en saks eller et barberblad giver en passende værktøj (B) til overførsel af juvenil blæksprutte.
s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg "/>
Figur 4. Eksempler data for en kolonisering assay. (A) Niveauer af bakterier i podestoffet skåle. (B) Luminescens individuelle blæksprutte. (C) Kolonitællinger individuelle blæksprutte. (D) Specifik luminescens af individuelle blæksprutte. Apo, Aposymbiotic (uncolonized negativ kontrol).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kolonisering beskrevne analyse giver mulighed for analyse af en naturlig symbiotisk proces i et kontrolleret laboratorium omgivelser. Som sådan kan den anvendes til at vurdere kolonisering af mutante stammer af forskellige naturlige isolater, og under forskellige kemiske systemer. Variationer i de beskrevne eksperimenter er almindeligt anvendt til at vurdere forskellige aspekter af symbiose. Kinetikken for kolonisering kan måles ved at undersøge luminescens under de første 24 timer, hvilket kan detekteres automatisk i en scintillationstæller, hvor sammenfald detektoren er blevet fjernet. Endvidere kan den relative kolonisering evne én stamme i forhold til hinanden, måles ved et kompetitivt kolonisering assay, i hvilken outputtet forholdet mellem de to stammer i en række dyr normaliseret til indgangen forholdet (forskellen detektion af særskilte antibiotikaresistens, fluorescens , eller kromogene [LacZ / Xgal] markører). Endelig kan kolonisering skal afbildes direkte ved konfokal MICRoscopy.
Det er kritisk at anvende sunde unge blæksprutte til forsøgene. Adfærdsmæssige indikatorer på dårlig blæksprutte sundhed omfatter svømme i cirkler (aflive dyret), eller dyr, der forbliver hvide og ikke ændrer deres chromatophores at blive brun på en mørk overflade (brug med omhu). Da der findes variation i modtagerlandene befolkninger, et større antal gentagne forsøg med et mindre antal dyr er ofte mere værdifuldt end et mindre antal replikater eksperimenter med store stikprøvestørrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Mattias Gyllborg efter blæksprutter facilitet støtte og for kommentarer til dette manuskript, Michael Hadfield og Kewalo Marine Laboratory for hjælp under feltet indsamlingen, og medlemmer af Ruby og McFall-Ngai Laboratorium for bidrag til denne protokol. Arbejdet i Mandel Laboratory understøttes af NSF IOS-0.843.633.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR international | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega Corp. | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega Corp. | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster & Smith | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith | CD-16881 | Prepare at 35 ≥ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalge Nunc international | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼", lower diameter 2 ¼", height 3". Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR international | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , PACON International. Honolulu, Hawaii. (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
