Summary
Metoden ger det förfarande genom vilket Hawaiian bobtail squid,
Abstract
Specifika bakterier finns i association med djurvävnad 1-5. Sådana värd-bakteriella föreningar (symbios) kan vara skadligt (patogena), har ingen kondition konsekvens (kommensalism), eller vara till nytta (mutualistic). Även om mycket uppmärksamhet har ägnats åt patogena interaktioner är lite känt om de processer som styr den reproducerbara förvärvet av nyttiga / bakteriefloran från omgivningen. Den Ijus-organet mutualism mellan den marina gramnegativ bakterie V. fischeri och Hawaiian bobtail squid, E. scolopes representerar en mycket specifik växelverkan där en värd (E. scolopes) fastställs ett symbiotiskt förhållande med endast en bakterieart (V. fischeri) under hela dess livstid 6,7. Bioluminiscens produceras av V. fischeri under denna interaktion ger en anti-aggressiv nytta för E. scolopes under nattliga aktiviteter 8,9, medanden näringsrika värdvävnad ger V. fischeri med en skyddad nisch 10. Under varje värd generation är detta förhållande rekapituleras, vilket motsvarar en förutsägbar process som kan bedömas i detalj i olika stadier av symbiotisk utveckling. I laboratoriet, om uppsamlades under de första 30-60 minuter och överfördes till symbiont-fritt vatten till juvenil bläckfisk luckan aposymbiotically (uncolonized), och, inte kan koloniseras förutom genom den experimentella inokulum 6. Denna samverkan ger således en användbar modell system för att bedöma de enskilda stegen som leder till specifika förvärv av ett symbiotiskt mikrob från omgivningen 11,12.
Här beskriver vi en metod för att bedöma graden av kolonisering som uppstår när nykläckta aposymbiotic E. scolopes utsätts för (konstgjord) havsvatten innehållande V. fischeri. Denna enkla analys beskriver ympning, naturlig infektion och återvinningav den bakteriella symbiont från den framväxande ljuset organ E. scolopes. Man ser till att ge en enhetlig miljö för djuren under symbiotisk utveckling, särskilt med avseende på vattenkvalitet och signaler ljus. Metoder för att karakterisera det symbiotiska befolkningen som beskrivs inkluderar (1) mätning av bakteriellt härrörande mareld, och (2) direkt koloniräkning av återvunnet symbionter.
Protocol
1. Framställning av bakteriella Inokula
- Dag 0
Två dagar före bläckfisk ympning, plåt relevanta bakteriestammarna på LBS 13 agar. - Inkubera bakterierna vid 25-28 ° C över natten.
- Dag 1
Inokulera 3 ml LBS medium i ett glas kultur rör med en koloni av varje V. fischeri stam för infektion. Förbered duplicera rör som backup. - Dag 2
(Samordna bakteriella steg 1,4-1,6 med bläckfisk steg 3.7-3.10)
1 timme före ympning, subkultur bakterier 1:80 (37,5 pl) i 3 ml LBS i ett glas kultur rör och växa i 1 h med luftning. - Mäta OD 600 av provet före inokulering. Typiska mätningar 0,3-0,6 beroende på stammen.
- För ett mål ymp av 3-5 x 10 3 CFU / ml beräkna ympvolym enligt följande: Inokulat volym (il) = 1,25 / OD 600 (t.ex. för OD 600 = 0,5, den beräknade inokulatet volym = 1.25/0.5 = 2,5 pl). Detta belopp läggs direkt till havsvatten innehåller bläckfisk i steg 4,1. Denna beräkning kan behöva justeras för olika stammar av V. fischeri eller för ympning på lägre eller högre nivåer än de som anges här.
2. Framställning av agarplattor för räkning av Inokula
- För varje behandling, etikett LBS plattor (2 per behandling) till platta prover på inokulum i steg 4,1.
- Tillsätt 5 sterila plätering pärlor per platta.
3. Insamling av Squid Juveniles
- Mät salthalten i Instant Ocean använda refraktometer och anpassa sig till 35 ‰.
- Filtrera 1 L av Instant Ocean användning filtreringsenheten och en fastsatt vakuumledning eller vakuumpump, för att generera filtersteriliserades Instant Ocean (FSIO). Syresätter vattnet genom att snurra kraftigt före varje dosering. The filterenhet kan återanvändas under 2 dagar.
- Alikvotera 40-50 ml FSIO i vardera av två (2) disponibla prov skålar. Märk ett så earlies och en som timelies.
- Förbered ett överskott av plast överföringspipetter för att förvärva unga bläckfisk genom att skära pipetten ca 1 cm från spetsen, över de lägsta åsarna (se figur 3). Detta underlättar ett större område genom vilket bläckfisken kan passera samband med hämtning. Kassera överföringspipetter där det är en grov exponerad yta.
- Med förberedda överföringspipetter, samla E. scolopes att kläckta natten och överföra till earlies skål FSIO. Tidiga ungar har varit i ägget systemet för över 1 h och är känsliga för kolonisering av förorenande V. fischeri i ägget systemet. Använd inte earlies för känsliga kolonisering experiment.
- Kontrollera ägg tankar var 30-45 min för nya ungar. Se till att alla ungar tas bort under varje cHeck. Ta bort ungar med en överföringspipett och sätter in timelies skål FSIO. Djur som samlats in i god tid finns för kolonisering experiment.
- När samlingen är klar (~ 45 minuter efter skymningen), överföra bläckfisk till huvud laboratoriet. Empiriskt är det fördelaktigt att kolonisera djuren under icke avbrutna betingelser laboratoriedjur ljus under 3 h inokuleringar.
- För varje behandling, förbereda en skål med 40 ml FSIO. Lägg squid till skålar för analysen (maximalt n = 40 per skål).
- Utarbetas ett kompletterande skålen som en aposymbiotic (negativ) kontroll.
- Förbered en särskild överföringspipett för varje behandling.
- Euthanize extra bläckfisk i 2% etanol.
4. Squid Colonization
- Dag 2 - Använda en P10 Pipetman, befria den beräknade alikvot av bakterier (steg 1,5) i varje bläckfisk skål (steg 3,8) för varje behandling. Starta en 3 h timer omedelbart efterden första ympningen.
- För varje behandling, skapa en "vortex" i skålen med den särskilda överföringspipetten genom att placera pipetten nära kanten av skålen och pipettera upp och ned flera gånger för att blanda vattnet och bläckfisk i ca 10 sek. Grundlig blandning är kritisk.
- Plate 50 pl från varje skål på en LBS agarplatta från steg 2,2 (för teknisk replikat, plåt två 50 pl plattor per behandling). Inkubera vid 25-28 ° C över natten.
- Framställ tvättbetingelser skålar (100 ml FSIO / EA) för varje behandling.
- Förbered Drosophila flaskor (4 ml FSIO / EA) för varje bläckfisk.
- Efter exakt 3 timmar, överföra bläckfisk respektive tvätt skålar (komplett för all behandling). Detta stoppar inokulering.
- Fortsätt att överföra varje enskild squid till sin egen Drosophila injektionsflaska med FSIO. Använd en utsedd överföringspipett för varje behandling.
- Flytta brickor med Drosophila flaskor till squid möjlighet att återgå till dagen / night ljuscykel djuren upplevt under embryogenes.
- Dag 3 - Förbered Drosophila flaskor (4 ml FSIO / EA) för varje bläckfisk.
- Innan skymningen vid 22-24 timmar efter ympning, överför varje bläckfisk till en ny Drosophila flaska. Använd en utsedd överföringspipett för varje behandling.
- Dag 4 - framställa märkta 1,5 ml mikrocentrifugrör (1/squid).
- Innan skymningen på 46-48 timmar efter ympning, mäta och registrera luminiscens varje bläckfisk i Drosophila flaskan (luminometer set för 6 s integration och auto-läsa på locket stängning).
- Som en negativ kontroll för bakgrundsluminescens, mäta en flaska med FSIO som inte innehåller någon bläckfisk.
- Överför varje bläckfisk i en volym av ca 700 | il till en 1,5 ml mikrocentrifugrör från Steg 4,12. Flytta till en kartong frys box. När locket placeras på lådan, ta inte det som de ljusa signaler för bakterier utvisning inte well-förstådd.
- Frysa mikrocentrifugrör vid -80 ° C över natten.
5. Fastställande av kolonisering nivåer
- För varje bläckfisk, förbereda två (2) mikrocentrifugrör med vardera 475 ul FSIO (eller autoklaveras 70% Instant Ocean).
- Framställ mortelstötar genom att först använda en Kimwipe att rengöra mortelstöt och avlägsna skräp och / eller vävnad.
- Ställe mortelstötar spets-och-ned i en 50 ml bägare innehållande 95% etanol. Etanol bör läggas till en höjd av ca 3 cm.
- För varje stöt, bort från bägaren och torka av spetsen med en Kimwipe.
- Doppa pistill tillbaka till etanol-bad, ta bort och sätta (spetsen uppåt) i ett mikrocentrifugrör rack och låt lufttorka helt i ca 15 minuter.
- Tina bläckfisk i ett mikrocentrifugrör rack (max n = 8).
- Om nödvändigt, justera volymen till 700 pl.
- Med hjälp av en mortelstöt från Steg 5,5 och störa djurvävnad tills bläcket sac RUPTures (vattnet blir en dunkel grå färg).
- Avlägsna mortelstöt och säkerställa att all vävnad stannar kvar i röret.
- Vortex vävnaden kort för exakt 10 sekunder (använd en timer).
- Tillåta vävnaden att vila i 10 min. Vävnaden kommer att sedimentera och bakterierna och bläck kvar i lösning. För beräkningarna som följer, är bakterierna / bläck lösning av [A] spädning (dvs. E. scolopes ljusorgan homogenat i 700 | il). Seriella 1:20 utspädningar ([B], [C]) beskrivs nedan.
- För [B] utspädning, tillsätt 25 | il [A] till en av de mikrocentrifugrör framställda i steg 5.1. Vortex.
- För [C] spädning, tillsätt 25 | il [B] till en av de mikrocentrifugrör framställda i steg 5.1. Vortex.
- Platta 50 pl av varje spädning på LBS agar, replikerar 2 per behandling.
- Inkubera plattorna vid 25-28 ° C över natten.
6. Dataanalys
- Att beräkna CFU / ljusorgan (LO), länt kolonier på plattan för varje behandling som 10-400 kolonier finns, och använda lämplig formel:
CFU / LO = (kolonier på [A] platta) x 14, eller
CFU / LO = (kolonier på [B] platta) x 280, eller
CFU / LO = (kolonier på [C] plattan) x 5600. - Plotta enskilda datapunkter och medianer på en logaritmisk skala.
- Uppgifterna är ofta normalt inte distribueras, med olika variationer och extremvärden kan innehålla biologiskt meningsfullt information. Därför är icke-parametriska tester ger en användbar metod för att bestämma huruvida de behandlingar varierar avsevärt.
- Använda programvaran GraphPad Prism för statistisk analys. För två behandlingar, använd Wilcoxon Rank Sum Test. För jämförelser mellan mer än två behandlingar, använda Kruskal-Wallis test med lämpliga post-test.
7. Representativa resultat
Resultaten från ett prov kolonisering analys visas i Figur 4. Två stammar av
Figur 1. Flödesschema för kolonisering förfarandet. Bakterier och bläckfisk skördas separat blandas sedan på den angivna inokulat. Bläckfisk tvättas, överförs sedan till nya vatten vid 3 h, 24 h och 4 8 h efter ympning. Vid 48 h luminescensen mäts och djuren fryses tjänar som att yt-sterilisera djuren. Light-organ koloniserade bakterier förbli livskraftig vid -80 ° C genom en upptining (inga ytterligare frys-tö-cykler).
Figur 2. Flödesschema som illustrerar homogenisering och utspädning plätering av bakterierna. Seriella 20-faldiga spädningar tillhandahålla en lämplig dynamiska området för räkning av koloniserade bakterier.
Figur 3. Överföringspipetter med en lämpligt smal axel avsmalnar till en smal borrning (A) som skulle skada juvenil bläckfisk. Förbehandling genom att skära av den smalaste delen med en sax eller ett rakblad ger ett lämpligt verktyg (B) för att överföra unga bläckfisk.
s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg "/>
Figur 4. Exempel på data för en kolonisation analys. (A) nivåer av bakterierna i inokulumet skålar. (B) Luminescence individuella bläckfisk. (C) Colony räknas av individuell bläckfisk. (D) Särskild luminiscens individuella bläckfisk. Apo, Aposymbiotic (uncolonized negativ kontroll).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Koloniseringen analysen som beskrivs möjliggör analys av en naturlig symbiotiskt process i en kontrollerad laboratoriemiljö. Som sådan kan den användas för att bedöma kolonisering av mutanta stammar, från olika naturliga isolat, och under olika kemiska system. Variationer av de beskrivna experimenten användes vanligen för att bedöma olika aspekter av symbios. Kinetiken för kolonisering kan mätas genom att undersöka luminescens under den första 24 h, vilket kan detekteras automatiskt i en scintillationsräknare i vilken sammanfaller detektorn har avlägsnats. Vidare kan den relativa koloniseringsförmåga av en stam i förhållande till en annan mätas genom en kompetitiv kolonisering analys, i vilken utsignalen förhållandet mellan de två stammarna i en uppsättning av djur är normaliserade till ingången förhållandet (differentiell detektion av distinkta antibiotikaresistens, fluorescens , eller kromogena [LacZ / Xgal] markörer). Slutligen kan kolonisering kan avbildas direkt av konfokal MICRoscopy.
Det är kritiskt att använda frisk ung bläckfisk för experimenten. Beteendemässiga indikatorer på dåligt bläckfisk hälsa omfattar simning i cirklar (euthanize djuret), eller djur som förblir vitt och ändrar inte sina chromatophores bli brun på en mörk yta (används med försiktighet). Eftersom det föreligger variationer i värdbefolkningens, är ett större antal upprepade experiment med mindre mängder djur ofta mer värdefull än ett mindre antal av upprepade experiment med stora provstorlekar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Mattias Gyllborg för bläckfisk anläggning stöd och för kommentarer på detta manuskript, Michael Hadfield och Kewalo Marine Laboratory om hjälp vid fältet insamling, och medlemmar av Ruby och McFall-Ngai Laboratoriet för bidrag till detta protokoll. Arbetet i Mandel laboratoriet stöds av NSF IOS-0.843.633.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR international | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega Corp. | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega Corp. | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster & Smith | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith | CD-16881 | Prepare at 35 ≥ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalge Nunc international | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼", lower diameter 2 ¼", height 3". Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR international | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , PACON International. Honolulu, Hawaii. (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
