البطانية نضوج خلية يتوسط المشارك ثقافة الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين في نهج التفاضل إخراج
Summary
الدراسة الحالية يصف نهجا موجها التمايز في حفز البنكرياس من تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. أهمية كبيرة هو أن العثور على نضوج الخلايا البطانية يتوسط شارك في ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المستمدة الأسلاف البنكرياس الى خلايا الانسولين تعبير.
Abstract
الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) واثنين من الخصائص الرئيسية: أنها يمكن أن تكون لأجل غير مسمى نشر في المختبر في حالة غير متمايزة، وأنها ذات قوة تناسلية متعددة، ومن ثم تكون له القدرة على التمايز إلى أنساب متعددة. هذه الخصائص تجعل المجالس الاقتصادية والاجتماعية جذابة للغاية لعلاج الخلايا والتطبيقات القائمة على العلاج التجديدي 1. ولكن لكامل إمكاناتها لتتحقق هذه الخلايا لا بد من التفريق في الظواهر ناضجة وظيفية، والتي هي مهمة شاقة. وثمة نهج واعدة في إحداث تمايز الخلايا هو محاولة لتقليد وعن كثب مسار توالد الأعضاء في إعداد المختبر في. ومن المعروف تنمية البنكرياس تحدث في مراحل معينة 2، بدءا من الأديم الباطن، والتي يمكن أن تتطور إلى أجهزة عدة، بما في ذلك الكبد والبنكرياس. لا يمكن أن يتحقق عن طريق الاستقراء الأديم الباطن من تعديل المسار العقدي من خلال إضافة Activin A 3 بالاقتران مع عوامل نمو عدة 4-7 </سوب>. خلايا الأديم الباطن نهائي ثم الخضوع لالتزام البنكرياس عن طريق تثبيط إنزيم القنفذ الصوتي، وهو ما يمكن تحقيقه في المختبر عن طريق إضافة سايكلوبامين 8. وتوسطت نضوج البنكرياس بنسبة الأحداث الموازية عدة بما في ذلك تثبيط الإشارات الشق؛ تجميع أسلاف البنكرياس إلى 3-dimentional مجموعات؛ تحريض الأوعية الدموية، على سبيل المثال لا الحصر. حتى الآن الأكثر نجاحا في المختبر من نضوج الخلايا المشتقة ESC سلف البنكرياس قد تحققت من خلال تثبيط الشق يشير بواسطة مكملات DAPT 9. على الرغم من نجاح، وهذا يؤدي إلى انخفاض العائد من النمط الظاهري ناضجة مع انخفاض وظيفة. وهناك مجال أقل درس هو تأثير الخلية البطانية يشير في نضوج البنكرياس، والذي يتزايد تقدير باعتباره عاملا مهما في المساهمة في الجسم الحي، البنكرياس نضوج جزيرة 10،11.
الدراسة الحالية يستكشف تأثير مثل هذه endothelخلية يشير الاتحاد العالمي للتعليم في نضوج ESC المستمدة من خلايا البنكرياس السلف في انتاج الانسولين جزيرة تشبه الخلايا. نحن الإبلاغ عن متعدد المراحل بروتوكول التمايز الموجهة حيث يتم لأول مرة المجالس الاقتصادية والاجتماعية التي يسببها الإنسان نحو الأديم الباطن بواسطة Activin وجنبا إلى جنب مع تثبيط مسار PI3K. ويتم تحقيق مواصفات البنكرياس من خلايا الأديم الباطن عن طريق تثبيط الإشارات من قبل القنفذ الصوتي سايكلوبامين جنبا إلى جنب مع الحث ريتينويد من قبل إضافة حمض الريتينويك. هو فعل المرحلة النهائية من النضج بواسطة إشارات الخلية البطانية التي حققتها تكوين ثقافة مشتركة. في حين تم اختبار العديد من الخلايا البطانية في الثقافة المشتركة، هنا نقدم البيانات المتوفرة لدينا مع خلايا الفئران الاوعية الدموية الدقيقة في القلب البطانية (RHMVEC)، في المقام الأول لسهولة تحليلها.
Protocol
Discussion
خلال تطوير البنكرياس، وخلايا البنكرياس التفريق على مقربة مع الخلايا البطانية من الشريان الأورطي، وعلاوة على ذلك، البنكرياس الجزر هي أوعية دموية كثيفة لتعزيز التبادل السريع للالسكر في الدم والهرمونات جزيرة. نظرا لهذه الحقائق، فإنه ليس من المستغرب أن الخلايا البطان…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة جائزة مبتكر جديد DP2 116520 وORAU رالف كلية جديد بوي جائزة تحسين.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Concentrations |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Straragene | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
Table 2. Reagents and Kits.
References
- De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l’embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131, 1651-1662 (2004).
- D’Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).
- Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438 (2009).
- Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes. Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).
- Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -. P., Chipperfield, H., Tan, E. -. K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage. Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).
- Kim, S. K., Melton, D. A. Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).
- Docherty, K. Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus. Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).
- Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -. P., Ferrara, N., Melton, D. A. The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation. Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).
- Yoshitomi, H., Zaret, K. S. Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a. Development. 131, 807-817 (2004).
- Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).
- Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).
