Endotel Cell Co-kultur formidler Modning af humane embryonale stamceller til pancreas-insulin-producerende celler i en rettet Differentiering Approach
Summary
Den aktuelle undersøgelse beskriver en rettet differentiering tilgang til at fremkalde bugspytkirtlen differentiering af humane embryonale stamceller. Af stor betydning er konstateringen af, at endotelcelle co-kultur medierer modning af humane embryonale stamceller afledt pancreas stamfædre til insulin udtrykker celler.
Abstract
Embryonale stamceller (ESC) har to egenskaber: de kan være uendeligt opformeres in vitro i en udifferentieret tilstand, og de er pluripotente og har således potentialet til at differentiere til flere slægter. Sådanne egenskaber gør ESC særdeles attraktiv for celle-baseret terapi og regenererende behandling ansoegninger 1. Men for sit fulde potentiale skal realiseres cellerne skal differentieres til modne og funktionelle fænotyper, hvilket er en skræmmende opgave. En lovende fremgangsmåde til induktion af cellulær differentiering er nøje efterligner bane organogenese i in vitro indstilling. Pancreasudviklingen vides at forekomme i bestemte trin 2, startende med endoderm, som kan udvikle sig til adskillige organer, herunder lever og pancreas. Endoderm induktion kan opnås ved modulation af nodal vej gennem tilsætning af activin A 3 i kombination med adskillige vækstfaktorer 4-7 </sup>. Endelige endoderm celler underkastes derefter pancreas engagement inhibering af sonisk pindsvin inhibering, som kan opnås in vitro ved tilsætning af cyclopamine 8. Pancreas modning medieres af adskillige parallelle arrangementer, herunder inhibering af indskæringen signaler aggregering af pancreas progenitorer i 3-dimensionelle klynger, induktion af vaskularisering, for at nævne nogle få. Langt den mest succesfulde in vitro modning af ØSU afledte pancreasstamfaderceller, er blevet opnået gennem hæmning af hak signalering af DAPT tilskud 9. Selv succes. Resulterer i et lavt udbytte af det modne fænotype med nedsat funktionalitet En mindre undersøgte område er virkningen af endotelcelle signalering i pancreas modning, hvilket i stigende grad værdsat som en vigtig bidragende faktor i in vivo pancreasø modning 10,11.
Den aktuelle undersøgelse udforskes sådan virkning af endothelIAL celle-signalering i modning af humane ESC afledte pancreasstamfaderceller i insulinproducerende ø-lignende celler. Vi rapporterer en flertrins rettet differentiering protokol, hvor de humane ESC først induceres mod endoderm af activin A sammen med inhibering af PI3K pathway. Pankreatisk specifikation endoderm celler opnås ved inhibering af sonisk hedgehog signalering ved Cyclopamine sammen med retinoid induktion ved tilsætning af retinsyre. Den endelige modning induceres af endotelcelle signalering opnås ved en co-kultur konfiguration. Mens flere endotelceller er blevet testet i co-kultur, heri præsenterer vi vores data med rotte hjerte mikrovaskulære endotelceller (RHMVEC), primært for at lette analysen.
Protocol
Discussion
Under pancreasudviklingen er differentierende pancreasceller i umiddelbar nærhed af endotelceller fra aorta, endvidere pancreasøer er tæt vaskulariseret at fremme en hurtig udveksling af blodglucose og ø-hormoner. I betragtning af disse fakta, er det ikke overraskende, at endotelceller spiller en vigtig rolle i processen med pancreas organogenese. Medens betydningen af endotelceller under pancreasudviklingen stigende grad værdsat, er dens rolle i in vitro differentiering af embryoniske celler mindre unders…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender støtte fra NIH New Innovator Award DP2 116520 og ORAU Ralph Powe Junior Faculty Enhancement Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Concentrations |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Straragene | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
Table 2. Reagents and Kits.
References
- De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l’embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131, 1651-1662 (2004).
- D’Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).
- Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438 (2009).
- Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes. Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).
- Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -. P., Chipperfield, H., Tan, E. -. K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage. Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).
- Kim, S. K., Melton, D. A. Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).
- Docherty, K. Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus. Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).
- Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -. P., Ferrara, N., Melton, D. A. The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation. Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).
- Yoshitomi, H., Zaret, K. S. Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a. Development. 131, 807-817 (2004).
- Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).
- Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).
