Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak
Summary
De huidige studie beschrijft een gerichte aanpak van differentiatie in het induceren van de alvleesklier differentiatie van humane embryonale stamcellen. Van grote betekenis is de bevinding dat endotheelcel co-cultuur bemiddelt rijping van menselijke embryonale stamcellen afkomstig van de pancreas voorlopercellen in insuline tot expressie brengen.
Abstract
Embryonale stamcellen (ESC) hebben twee belangrijke kenmerken: zij kunnen voor onbepaalde tijd gekweekt in vitro in een ongedifferentieerde staat en ze zijn pluripotent, waardoor er meer mogelijkheden om te differentiëren in meerdere geslachten. Dergelijke eigenschappen maken SER zeer aantrekkelijk voor cel-gebaseerde therapie en regeneratieve behandeling aanvragen 1. Echter zijn volle potentieel worden gerealiseerd de cellen worden onderscheiden in volwassen en functionele fenotypen, een moeilijke taak. Een veelbelovende benadering induceren celdifferentiatie is het pad van toestanden in nauw Organogenese in vitro omgeving. Pancreas ontwikkeling is bekend dat het voorkomen in specifieke fasen 2, te beginnen met endoderm, die kunnen leiden tot verschillende organen, waaronder de lever en de alvleesklier. Endoderm inductie kan worden bereikt door modulatie van de knooppunten pad door toevoeging van activine A 3 in combinatie met verschillende groeifactoren 4-7 </sup>. De definitieve endoderm cellen vervolgens aan de alvleesklier toezegging door remming van sonic hedgehog remming, die in vitro worden bereikt door toevoeging van cyclopamine 8. Pancreas rijping wordt gemedieerd door een aantal parallelle evenementen, waaronder remming van de inkeping signalering, aggregatie van de pancreas voorlopercellen in 3-dimensionale clusters; inductie van vascularisatie, een paar te noemen. Verreweg de meest succesvolle in vitro maturatie van ESC afgeleide pancreas voorlopercellen zijn bereikt door remming van de inkeping signalering door dApt suppletie 9. Hoewel succesvol, resulteert in een lage opbrengst van het rijpe fenotype met beperkte functionaliteit. Een minder bestudeerde gebied is het effect van endotheelcellen signalering in de alvleesklier rijping, die steeds meer wordt gewaardeerd als een belangrijke factor in de in-vivo eilandjes van Langerhans rijping 10,11.
De huidige studie onderzoekt dergelijke effecten van endothelial cel signalisatie in de rijping van de menselijke ESC afgeleide pancreas voorlopercellen naar insuline producerende eilandjes van Langerhans-achtige cellen. We brengen verslag uit van een multi-stage gericht differentiatie protocol waar de menselijke sociaal-economische raden het eerst naar endoderm veroorzaakt door Activin A, samen met remming van de PI3K. Pancreas specificatie van endoderm cellen wordt bereikt door remming van sonic hedgehog signalering door Cyclopamine samen met retinoïde inductie door toevoeging van retinoïnezuur. De laatste fase van rijping wordt veroorzaakt door endotheelcellen signalering bereikt door een co-cultuur configuratie. Terwijl een aantal endotheelcellen zijn getest in de co-cultuur, hier presenteren wij onze gegevens met rattenhart microvasculaire endotheelcellen (RHMVEC), voornamelijk voor het gemak van de analyse.
Protocol
Discussion
Tijdens de pancreas ontwikkeling, waarbij een onderscheid pancreatische cellen zijn in de nabijheid met de endotheelcellen van de aorta, bovendien, pancreas-eilandjes zijn dicht gevasculariseerd voor een snelle uitwisseling van bloed glucose en eilandje hormonen te bevorderen. Gezien deze feiten, is het niet verwonderlijk dat de endotheliale cellen een belangrijke rol in het proces van de alvleesklier organogenese te spelen. Het belang van endotheelcellen in pancreas ontwikkeling steeds gewaardeerd, wordt de rol in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de steun van NIH New Innovator Award DP2 116520 en ORAU Ralph Powe Junior Faculteit Enhancement Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Concentrations |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Straragene | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
Table 2. Reagents and Kits.
References
- De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l’embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131, 1651-1662 (2004).
- D’Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).
- Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438 (2009).
- Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes. Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).
- Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -. P., Chipperfield, H., Tan, E. -. K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage. Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).
- Kim, S. K., Melton, D. A. Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).
- Docherty, K. Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus. Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).
- Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -. P., Ferrara, N., Melton, D. A. The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation. Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).
- Yoshitomi, H., Zaret, K. S. Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a. Development. 131, 807-817 (2004).
- Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).
- Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).
