Summary
Der Schwanz-Suspension-Test ist als ein experimentelles Verfahren zur antidepressiven Wirksamkeit von medikamentösen Behandlungen bei Mäusen zu bewerten validiert. Mäuse sind an ihren Schwänzen für sechs Minuten unterbrochen und die Flucht Verhaltensweisen bewertet werden. Wir beschreiben die Verfahren bei der Durchführung der Schwanz Suspensionsversuch verwendet.
Abstract
Der Schwanz-Suspension-Test ist eine Maus Verhaltenstest sinnvoll in das Screening von potenziellen Antidepressiva, und die Beurteilung der andere Manipulationen, die voraussichtlich Depression Verhaltensweisen beeinflussen. Mäuse sind durch ihre Schwänze mit Klebeband ausgesetzt, in einer solchen Position, dass es nicht entweichen kann oder halten in der Nähe Oberflächen. Während dieses Tests in der Regel sechs Minuten Dauer werden die daraus resultierenden Flucht orientierte Verhaltensweisen quantifiziert. Der Schwanz-Suspension-Test ist ein wertvolles Werkzeug in der Wirkstoffforschung für das Hochdurchsatz-Screening von potenziellen antidepressiven Verbindungen. Hier beschreiben wir die Einzelheiten der Durchführung dieses Tests mit zusätzlichen Schwerpunkt auf potenzielle Probleme, die auftreten und wie sie vermieden werden müssen. Wir bieten auch eine Lösung für das Heck Klettern Verhalten, ein häufiges Problem, dass dieser Test nutzlos in einigen Mausstämmen macht, wie das weit verbreitete C57BL / 6. Genauer gesagt, verhindern wir tail Klettern Verhalten, indem Mäuseschwänzen durch einen kleinen Kunststoff-Zylinder vor der Aussetzung. Schließlich haben wir ausführlich, wie Sie manuell Gäste die Verhaltensweisen, die in diesem Test manifestiert sind.
Protocol
1. Materialien
1. Suspension Box
Der Schwanz-Suspension-Test (TST) beinhaltet das Suspendieren Mäuse über dem Boden an ihren Schwänzen. Auf der untersten Ebene, das Verfahren erfordert nur eine Suspension bar oder in einem Regal Sims, und Band. Allerdings sollte der Experimentator betrachten den Einsatz von einem Hintergrund, der optimalen Kontrast bietet. Darüber hinaus ist es ratsam, Schritte, um Mäuse aus der Beobachtung anderer Tiere, die getestet werden zu verhindern. In unserem Labor verwenden wir speziell gefertigte Aufhängung Schwanz-Boxen (Vier-Stunden-Tag, Baltimore MD), aus Kunststoff mit den Abmessungen (55 x 60 Höhe Breite x 11,5 cm Tiefe) aus. Um Tiere aus der Beobachtung oder Interaktion untereinander zu vermeiden, wird jeder Maus innerhalb des eigenen drei Wänden rechteckige Kammer (55 Höhe X 15 X 11,5 cm Breite Tiefe) suspendiert. Die Maus ist in der Mitte dieses Fach suspendiert, und die Breite und Tiefe sind ausreichend dimensioniert, so dass die Maus nicht machen coNTACT mit den Wänden. In dieser Einstellung wird die ungefähre Entfernung zwischen der Maus die Nase und die Vorrichtung Boden 20-25 cm. Es gibt vier solcher identischen Fächern in der Apparatur ermöglicht es uns, vier Mäuse in einer Zeit, zu testen. Ein Aluminium-Fahrwerk bar (1 cm. Höhe x 1 cm. Breite x 60 cm. Länge), verwendet werden, um den Schwanz jeder Maus einzustellen, ist auf der Oberseite der Box positioniert. Die Dimensionen, die wir in unserem Labor sollte als allgemeine Referenz angesehen werden. Zum Beispiel kann die Größe der einzelnen Fächer des Schwanzes-Suspension-Box erhöht werden, wenn eine große outbred Mausstamm (z. B. CD-1) verwendet wird.
Am unteren Ende jedes Fach legen wir einen abnehmbaren Aluminium-Tablett, Kot oder Urin sammelt von den Tieren. Wir verwenden ein dunkelgraues Kästchen für Albino-Tiere und eine cremefarbene Box für Mäuse von anderen Farbschlägen. Diese Anordnung gibt uns einen besseren Kontrast und damit zuverlässiger Verhaltens-Scoring des Tests.
2. Band
3. Timer
4. Video Aufnahmegerät
Eine Videokamera und ein Stativ (oder andere Tragstruktur) benötigt. Da dieser Test in der Regel umfasst mehrere Tiere zur gleichen Zeit getestet werden Livescoring schwierig und wird nicht empfohlen. Die Videokamera sollte in hallo Rekordgh genügend Auflösung zu einer Bildqualität, die später für Verhaltens-Scoring verwendet werden rendern. Stets darauf achten, dass genügend Speicherkarten mit der Kamera vor dem Test. Wir verwenden eine Video-Kamera, die digital Datensätze ohne den Einsatz physischer Medien (zB Video-Kassette), so dass für einfache Übertragung von Videos.
5. Weißes Rauschen-Generator
Der Rauschgenerator sollten Maske intermittierende Umgebungsgeräusche. Die Verwendung eines Noise-Generator ist besonders in Laborumgebungen, wo plötzliche, laute Geräusche gehört, dass würde möglicherweise erschrecken Mäusen kann empfohlen. In unseren experimentellen Raum Geräuschpegel der Umgebung (ohne das weiße Rauschen-Generator aktiviert) wird um 60 dB. Die Gesamt-Geräuschpegel mit dem weißen Rauschen-Generator an der Stelle, wo die TST durchgeführt wird aktiviert ist 70-72 dB. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass diese Zahlen nur als Beispiel zur Verfügung gestellt werden, und jedes Labor sollte die AuswahlRecht Geräuschpegel entsprechend ihrer einzigartigen Umgebung und Umstände.
6. Reinigungsmittel
Die Suspension Box gründlich nach jeder Sitzung gelöscht werden mit einer Sterilisation Lösung (z. B. MB-10, Quip Laboratories Inc., Wilmington, DE, oder ähnliches).
7. Climbstoppers (optional: abhängig von Stamm)
Mäuse von einigen Hintergründen, wie zB C57BL / 6, kann ihre Schwänze während der Test 1 zu klettern. Klare Hohlzylinder (4 cm Länge, 1,6 cm Außendurchmesser, 1,3 cm Innendurchmesser, 1,5 Gramm), die zu vier cm Länge (von FourHourDay Inc, Baltimore MD) aus Polycarbonat-Schlauch (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs geschnitten werden , CA) sind rund um die Schwänze der Mäuse der Lage, diesen Schwanz Steigverhalten 2,3 verhindern. Diese Geräte können in jedem Labor mit gängigen Werkzeugen und Materialien hergestellt werden.
2. Behavioral Procedures
- Legen Sie die Kamera in Position. Die Kamera sollte so nah wie möglich sein, um die höchstmögliche Auflösung der Tiere zu erhalten.
- Tape-Fragmente, die während der Sitzung verwendet werden soll geschnitten, markiert und vorbereitet für die Sitzung.
- Starten Sie das weiße Rauschen, wenn verwendet wird, bevor die Mäuse auf den Prüfraum eingebracht werden. Der Pegel des weißen Rauschens sollte nur genug, um Außengeräusche Maske. Vermeiden Sie eine hohe Lautstärke und stellen Sie sicher, das gleiche Niveau von weißem Rauschen für alle Tiere verwendet wird.
- Bringen Sie den ANimals in den Testraum. Wenn der Raum, wo die Tiere leben und den Prüfraum nebeneinander mit ähnlichen Umgebungsbedingungen sind, kann keine Eingewöhnungszeit erforderlich. Andernfalls setzen Sie die Tiere in den Prüfraum für einen Zeitraum von Akklimatisation (in der Regel mindestens eine Stunde). Seien Sie sich bewusst, dass die anderen Tiere im selben Raum platziert werden können Geruchs-und Ultraschall-Signale Sinn.
- Wenn ein Stamm bekannt, ihre Schwänze, wie C57BL6 / J klettern, wird statt Climbstoppers um die Schwänze verwendet vor dem Aufbringen der Band.
- Halten Sie das Band an die Schwänze der Mäuse. Verwenden Sie das markierte Ende des Bandes und stellen Sie sicher, das Band hält sich an den Schwanz und auf sich selbst zurück. Das Band sollte bis zum Ende des Schwanzes mit 2-3 Millimeter Schwanz noch außerhalb des Bandes aufgebracht werden.
- Nach jedem Stück Klebeband ist eine Maus Schwanz befestigt Stick den mittleren Teil des Bandes an den Innenwänden des Käfigs. Dadurch wird verhindert Kabelgewirr von Band Stücke zueinander. Beachten Sie, dass confinement auf diese Weise kann Stress verursachen und dass es wichtig ist, um den Prozess der Anwendung der Band auf jedes Tier so schnell wie möglich abzuschließen.
- Sobald alle Band angewendet wird, starten Sie die Aufnahme und Identifizierung der Sitzung, bevor die Mäuse ausgesetzt sind.
- Suspend die Tiere, indem das freie Ende des Bandes über die Aussetzung bar oder in einem Regal in eine Ordnung, die zwischen den Behandlungsgruppen ausgeglichen wird. Suspend-Mäuse in einer Weise, dass nicht die Erfüllung der Kamera-Ansicht, weil die gesamte TST-Sitzung werden erzielt werden und behindern die Kamera auf die Unfähigkeit führen zu Verhaltensweisen in dieser Zeit zu bewerten ist. Prüfen Sie, ob alle Band Enden sind parallel hängen, die Aussetzung bar oder in einem Regal mit einer ähnlichen Länge von slack für jeden Maus.
- Am Ende der Sitzung (in der Regel 6 Minuten), Rückkehr der Tiere, ihre homecage und entfernen Sie vorsichtig das Klebeband von jedem Schwanz indem Sie es vorsichtig aus. Nicht rip das Band aus dem Schwanz da dadurch kann es zu Schmerzen an den Mic-Ursachee.
- Nach der Rückkehr der Mäuse, um ihre Kolonie Zimmer verwerfen die fäkale Boli und Urin aus der Auffangwannen und wischen Sie das Gerät mit einer sterilisierenden Lösung.
3. Behavior Analysis
- Im Allgemeinen ist die TST von Anfang bis 6 Minuten lang zu beenden. Im Gegensatz zu anderen weit verbreiteten antidepressive Wirksamkeit Verfahren, die Forced Swim Test ist die ganze Session gewertet. Dies ist aufgrund der allgemeinen Feststellung, dass Mäuse zu manifestieren Unbeweglichkeit neigen früher in der TST.
- In unserem Labor stellen wir Ihnen die Video-Dateien direkt von der Kamera an einen PC, wo die Analyse durchgeführt wird.
- Während der Verhaltensanalyse der Zeit, dass jede Maus als mobile gemessen verbringt. Während es möglich ist, die Unbeweglichkeit der Zeit direkt zu messen, haben wir festgestellt, es einfacher zu erkennen und zu messen aktiven Bewegungen, anstatt das Fehlen solcher Bewegungen.
- Der wichtigste Aspekt des TST Verhaltensanalyse ist die konsistente Identifikation der Bewegungs, die als bona fide Mobilität erfasst werden. Mäuse, vor allem zu Beginn der Sitzung, manifest Verhaltensweisen, die offen zu entkommen verwandt sind. Dazu zählen versuchen, die Wände des Apparates und die Suspension bar, starkes Schütteln des Körpers, und die Bewegung der Gliedmaßen ähnlich laufen zu erreichen. Diese Bewegungen stellen eindeutig Mobilität. Diese Verhaltensweisen dann nachlassen und sich subtiler. In unserem Labor kleinen Bewegungen, die die Vorderbeine beschränkt sind, jedoch ohne die Beteiligung der Hinterbeine sind nicht als Mobilität gezählt. Zudem sind die Schwingungen und Pendel wie Schaukeln, dass aufgrund der Dynamik während der frühere Beweglichkeit Kämpfe sind auch nicht als Mobilität gezählt.
- In unserem Labor verwenden wir eine On-Screen-Stoppuhr-Software für Zeitmessungen (XNote Stoppuhr, dnSoft Research Group). Zwei getrennte Stoppuhren werden auf dem Bildschirm verwendet. Die erste Stoppuhr zählt von 360 Sekunden und warnt den Betrachter, wenn die Verhaltensanalyse endet. Die zweite stodurch den Beobachter-Maßnahmen die Zeit, mobilen pwatch-gesteuert. Bestimmte Stoppuhr-Software hat die Fähigkeit, Schlüssel zuordnen zu starten und zu stoppen Funktionen, so dass auf dem Bildschirm die Tastatur können Sie die Stoppuhr zu kontrollieren. Statt einer herkömmlichen Tastatur, verwenden wir ein Eingabegerät gemeinhin als 'Gamepad', um den Stoppuhren Steuerung bekannt.
- Wenn es mehr als eine Maus getestet und auf dem Bildschirm ist es eine gute Idee, die anderen Tiere decken, so dass ihre Bewegungen nicht ablenken des Betrachters. Dies kann durch ein anderes Programm-Fenster oder durch physisch für die anderen Mäuse auf dem Bildschirm mit Papier durchgeführt werden.
- Es kann einige Bias auftritt, wenn der Gesamtbetrag der Mobilität der Zeit für eine bestimmte Maus verstrichen ist sichtbar vor Abschluss der Analyse-Sitzung. Wenn ein On-Screen-Stoppuhr verwendet wird, empfehlen wir, alle, aber die Millisekunde Dezimalstellen der Stoppuhr zu decken. Durch die Abdeckung der Stoppuhr der Beobachter nur weiß, ob die Stoppuhrein-oder ausschalten zu jedem Zeitpunkt weiß aber nicht, die insgesamt verstrichene Zeit und kann daher nicht betroffen sein von jeder Voreingenommenheit. Mit diesem Ansatz den Betrachter, während blind für die Gruppenzugehörigkeit der Tiere, wird nicht über eine allgemeine Vorstellung von Maß an Mobilität in jedem Tier.
- Ein Interobserver Zuverlässigkeit Test sollte für jeden neuen Beobachter durchgeführt werden, bevor Daten von Versuchstieren zu sammeln. In unserem Labor jedem neuen Beobachter ersten Uhren ein erfahrener Beobachter, während er oder sie ist Scoring. Nach den neuen Beobachter genug Vertrauen, um die Mobilität von Immobilität unterscheiden zu gewinnen, sie dann Partitur in Echtzeit mit dem erfahrenen Beobachter beobachten und darauf hingewiesen Fehler. Sobald diese Phase erfolgreich abgeschlossen ist, wird die neue Beobachter analysieren eine bestimmte Gruppe von TST Videos, die wir pflegen in unserem Labor für Schulungszwecke. Erst nach ein hohes Maß an Interobserver Korrelation mit dem erfahrenen Beobachter erhalten ist, bedeutet ein Ermittler analysieren TST Videos von den tatsächlichenExperimente. Wir archivieren die Daten aus diesen Trainings-Analysen auf einen internen Standard für das Labor darstellen. Wir haben Unterschiede zwischen den Stämmen in der Art und Weise, in der sie ausdrücken Mobilität (und Unbeweglichkeit) Verhalten und meine Unbeweglichkeit Zeit zwischen den Geschlechtern beobachtet. Wenn ein neuer Stamm, Geschlecht oder genetisch veränderte Maus-Modell im Labor getestet wird, ist es notwendig, wieder verpflichten diese Art der Zuverlässigkeitsanalyse.
4. Repräsentative Ergebnisse
Wir haben die TST zur Antidepressiva-ähnliche Reaktionen auf Lithium-Behandlung in verschiedenen Mausstämmen (Abbildung 1) 3 zu bewerten. Experimentelle Einzelheiten dieses Experiments sind in Can et al., 2011 3 veröffentlicht.
Abbildung 1. Immobilitätszeit in den Schwanz Suspensionsversuch nach chronischer Lithium-Verwaltung in fünf Inzucht-Mausstämmen. Die Mäuse wurden Gruppenhausd, vier Mäuse pro Käfig. Mäuse in der Lithium-Behandlung erhielten Lithium-chow mit 4 g / kg LiCl für drei Wochen. Kontrolltiere erhielten identische Lebensmittel ohne Lithiumchlorid. **: P <0,01, ***: p <0,001 bedeuten eine signifikante, ungepaarten t-Test. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. n :10-12 Tieren pro Gruppe für jeden Stamm. (Bild von 3 wiedergegeben).
In diesem Beispiel ist eine signifikante therapeutische Wirkung von chronischer Lithium in Essen geliefert nur in C57BL/6J und DBA/2J Stämme beobachtet. In den anderen drei Stämme, wurde keine statistisch signifikante Abnahme der Unbeweglichkeit der Zeit beobachtet. Diese Daten zeigen, dass eine Antidepressiva-ähnliche Reaktion auf chronische Lithium-Behandlung ist abhängig Belastung als auch mit anderen Antidepressiva 4-8 beobachtet worden.
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Discussion
Die Entwicklung des TST durch Steru et al. 9 wurde durch die bisher entwickelten Forced Swim Test 10-12 beeinflusst. Ähnlich wie bei den Forced Swim Test, in der TST-Mäuse sind in eine unausweichliche, aber mäßig belastenden Situation. Mangelnde entkommen Verhaltensweisen gilt Unbeweglichkeit. Wie die Forced Swim Test ist das TST ein Test am besten für die Bewertung der antidepressiven Wirksamkeit von Medikamenten überprüft, sondern auch verwendet, um die Auswirkungen der Umwelt-, neurobiologischen und genetischen Manipulationen 13-18 bewerten. Im Gegensatz zu den Forced Swim Test, in der TST besteht keine Gefahr der Unterkühlung durch Untertauchen in Wasser 19. Die Experimentatoren sollten daran denken, dass, während die Forced Swim Test und TST ähnlich Anscheinsbeweis sind, gibt es verschiedene wichtige Unterschiede in ihrer Empfindlichkeit und Leistung und die Ergebnisse eines Tests müssen nicht unbedingt in den anderen repliziert werden. Für eine ausgezeichnete Darstellung der Unterschiede bVergleicht man diese beiden Tests finden Sie in den folgenden Referenzen 4,20,21. Obwohl die meisten Antidepressiva Wochen in Anspruch nehmen, um klinisch signifikante Effekte bei Patienten ausüben, können Antidepressiva entfalten ihre Wirkung in der TST und Forced Swim Test sowohl nach akuter und chronischer Behandlungen 20,22,23. Es gibt jedoch viele andere Verhaltens-Tests verwendet werden, um Antidepressiva-ähnliche Wirkungen bei Mäusen, die in der Regel empfindlich auf eine chronische Behandlung nur zu beurteilen. Dazu gehören chronische unvorhersehbare Belastungen 24, sozialen Niederlage Stress 25, und Novum unterdrückt Fütterung 26.
Zusätzlich zu seinen geringen Platzbedarf, niedrige Kosten und relativ einfachen Setup ist die Automatisierung der Datenerfassung in der TST auch möglich, 9,27,28. Zwei wesentliche Ansätze für die Automatisierung sind elektro-mechanische Messsysteme und Videoanalyse. In den elektro-mechanischen Ansatz, ist das Tier aus einem DMS suspendiert und die Bewegungen der Tiere gemessen werden (z. B. Med Associates Inc, St. Albans, VT, Harvard Apparatus, Holliston, MA). Ein weiterer Ansatz ist eine Software-basierte Analyse von TST Videoaufzeichnungen (zB Noldus Inc., Niederlande; Cleversys Inc., Reston, VA). Aber auch mit der Automatisierung wird menschliche Intervention weiterhin notwendig sein, da die angewandten Parameter für jeden neuen Mausmodell oder Belastung angepasst werden muss und die Ergebnisse sollten durch einen menschlichen Beobachter zur Qualitätskontrolle überprüft werden.
Ein hartnäckiges Problem, dass besondere Aufmerksamkeit verdient mit der TST ist der Schwanz-climbing Verhalten einiger Mäuse, vor allem die häufig verwendeten C57BL / 6 Stammes 1,20. Diese Tiere haben eine Neigung zu erreichen und Klettern für ihren eigenen Schwanz. Mäuse, die erfolgreich besteigen ihre Schwänze haben gelernt, dass Flucht möglich ist. Solche Mäuse sollten daher von der Analyse, die die Anzahl der Mäuse erforderliche Zu-und Abnahmen Zuverlässigkeit des Verfahrens ausgeschlossen werden. Die Tatsache, dass der C57BL / 6 Maus-Stamm der c istGEMEINSAME Belastung in neurobiologische und genetische Forschungen verwendet wird verschärft den Einfluss dieses Problem. In diesem Papier haben wir eine Lösung für tail-Klettern Verhalten, das in unserem Labor entwickelt wurde 2,3 detailliert. Um die tail-Klettern Verhalten zu verhindern, setzen wir Hohlzylinder um Basis des Schwanzes von Mäusen. Die Mäuse können nicht auf diese Zylinder halten und kann daher nicht besteigen ihren Schwänzen. Wir haben beobachtet, dass keine Mäuse haben ihre Schwänze stieg bei diesem Ansatz 2,3. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Antidepressiva-ähnliche Wirkungen von Lithium, berichtete zuvor in der TST, ohne dass diese Arten von Zylindern 29, sind noch vorhanden, wenn mit ihnen 3.
Es wird darauf hingewiesen, dass die TST nicht für schwerere Nagetieren wie Ratten zu empfehlen, da es möglicherweise schmerzhaft für die Tiere, um ihr Gewicht nur durch ihre Schwänze zu unterstützen. Aus dem gleichen Grund ist Vorsicht geboten bei ungewöhnlich schwere Mäuse (z. B. Mäuse verwendet genommen werdenModellierung Adipositas), und in diesen Fällen die Experimentatoren sollten alternative Tests wie der Forced Swim Test 10 Es im Auge behalten sollte, dass alle Manipulationen, die die gesamte Aktivität beeinträchtigen können potenziell verändern Mobilität in der TST führt zu falschen Schlussfolgerungen zu suchen. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Ergebnisse der TST mit separatem Verhaltenstests, dass insgesamt Aktivität bei Mäusen, wie die Open-field Test 30 messen zu überprüfen.
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Disclosures
Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Gewährung Nihm R01 und R21 MH091816 MH084043 TDG unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tape | |||
| Timer | |||
| Video Camera | |||
| White Noise Generator (optional) | |||
| Climbstoppers (optional; depending upon strain used) |
References
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