Summary
O teste de tail-suspensão é validado como um procedimento experimental para avaliar a eficácia antidepressiva de tratamentos com drogas em camundongos. Os ratos são suspensos por suas caudas de seis minutos e escapar comportamentos relacionados são avaliados. Descrevemos os procedimentos utilizados na condução do teste de suspensão da cauda.
Abstract
O teste de tail-suspensão é um teste comportamental do rato úteis na triagem de potenciais medicamentos antidepressivos e avaliação de outras manipulações que são esperados para influenciar os comportamentos relacionados com a depressão. Os ratos são suspensos por suas caudas com fita adesiva, em uma posição tal que não possa fugir ou agarrar a superfícies próximas. Durante este teste, normalmente seis minutos de duração, os comportamentos de fuga resultando orientados são quantificados. O teste de tail-suspensão é uma valiosa ferramenta na descoberta de medicamentos de alto throughput screening de potenciais compostos do antidepressivo. Aqui, descrevemos os detalhes necessários para a implementação deste teste, com ênfase adicional sobre potenciais problemas que podem ocorrer e como evitá-los. Nós também oferecemos uma solução para o comportamento da cauda de escalada, um problema comum que torna este teste inútil em algumas linhagens de camundongos, como o C57BL amplamente utilizado / 6. Especificamente, evitar comportamentos de cauda subindo, passando rabos de rato através de um plástico pequenocilindro antes da suspensão. Finalmente, detalhes como pontuação manualmente os comportamentos que se manifestam neste teste.
Protocol
1. Materiais
1. Box suspensão
O teste de tail-suspensão (TST) envolve ratos suspensão acima do solo por suas caudas. No nível mais básico, o procedimento requer apenas uma barra de suspensão ou borda de prateleira, e fita. No entanto, o pesquisador deve considerar o uso de um fundo que proporciona um contraste perfeito. Além disso, é prudente tomar medidas para evitar ratos a partir da observação de outros animais que estão sendo testados. Em nosso laboratório, utilizamos caixas de cauda especialmente fabricados suspensão (Four-Hour Day, Baltimore MD), feito de plástico com as dimensões (55 altura X 60 largura X 11,5 cm de profundidade). A fim de evitar que os animais a partir da observação ou interagindo entre si, cada rato é suspenso dentro de seu compartimento de três paredes própria retangular (55 altura X 15 largura X 11,5 cm de profundidade). O mouse é suspenso no meio deste compartimento ea largura e profundidade são suficientemente dimensionada de modo que o mouse não pode fazer contact com as paredes. Neste cenário, a distância aproximada entre o nariz do rato e do piso aparelho é de 20-25 cm. Existem quatro compartimentos tais idênticos no aparelho que nos permite testar quatro camundongos de cada vez. Uma barra de suspensão de alumínio (1 cm. Altura X 1 cm. Largura x 60 cm comprimento.), A suspensão da cauda de cada rato, é posicionado na parte superior da caixa. As dimensões que usamos em nosso laboratório deve ser considerado como uma referência geral. Por exemplo, o tamanho de compartimentos individuais da caixa de cauda suspensão pode ser aumentada se uma cepa de rato grande outbred (por exemplo, CD-1) é usado.
No fundo de cada compartimento, colocamos uma bandeja de alumínio destacável que recolhe as fezes ou urina dos animais. Usamos uma caixa cinza escuro para animais albinos e uma caixa de cor creme para os ratos de cores do revestimento outros. Este arranjo nos dá um melhor contraste e, portanto, mais confiável scoring comportamental do teste.
2. Fita
3. Cronômetro
4. Dispositivo de gravação de vídeo
Uma câmera de vídeo e um tripé (ou outra estrutura de apoio) são necessários. Dado que este teste geralmente envolve vários animais sendo testados ao mesmo tempo, marcando ao vivo vai ser difícil e não é aconselhado. A câmera de vídeo deve registrar em oigh resolução suficiente para gerar uma imagem de qualidade que será usada mais tarde para marcar comportamentais. Sempre a certeza de que não há memória de gravação suficiente na câmera antes de iniciar o teste. Usamos uma câmera de vídeo que grava digitalmente sem o uso de meios físicos (ou seja, fita de vídeo), permitindo a transferência direta de vídeos.
5. Gerador de ruído branco
O gerador de ruído intermitente deve máscara sons ambientais. O uso de um gerador de ruído é particularmente recomendado em ambientes de laboratório, onde súbitos ruídos altos podem ser ouvidos que potencialmente assustar ratos. Na nossa sala experimental, o nível de ruído ambiente (sem o gerador de ruído branco activada) é em torno de 60 dB. O nível sonoro total com o gerador de ruído branco ativado no local onde o TST é conduzido é 70-72 dB. No entanto, deve-se notar que estes números são fornecidos como exemplo apenas, e cada laboratório deve selecionar odireito níveis de ruído de acordo com seu ambiente único e circunstâncias.
6. Materiais de limpeza
A caixa de suspensão deve ser limpo após cada sessão com uma solução de esterilização (por exemplo, MB-10, Quip Laboratories Inc., Wilmington, DE, ou similar).
7. Climbstoppers (opcional: depende da cepa utilizada)
Camundongos de alguns fundos, como C57BL / 6, pode subir suas caudas durante o teste 1. Claro cilindros ocos (4 cm de comprimento, 1,6 centímetros de diâmetro externo, 1,3 centímetros de diâmetro interno, 1,5 gramas), que são cortados a quatro cm de comprimento (por FourHourDay Inc, Baltimore MD) a partir de tubos de policarbonato (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs , CA) são colocados em torno da cauda de camundongos para evitar a cauda como um comportamento escalar 2,3. Estes dispositivos podem ser feitos em qualquer laboratório com ferramentas e materiais comuns.
2. Procedimentos comportamentais
- Coloque a câmera na posição. A câmera deve ser o mais próximo possível, a fim de obter a maior resolução possível dos animais.
- Fragmentos de fita que será usado durante a sessão deve ser cortado, marcado, e se preparou para a sessão.
- Iniciar o gerador de ruído branco, se a ser utilizado, antes de os ratos são introduzidos para a sala de testes. O nível de ruído branco só deve ser suficiente para mascarar ruídos externos. Evitar um alto volume e certifique-se o mesmo nível de ruído branco é usado para todos os animais.
- Traga a umaimals para a sala de testes. Se a sala onde os animais residem e sala de ensaios são adjacentes uns aos outros com as mesmas condições ambientais, sem período de aclimatação pode ser necessária. Caso contrário, colocar os animais na sala de ensaio durante um período de aclimatação (geralmente pelo menos uma hora). Esteja ciente de que os outros animais colocados na mesma sala pode sentir sinais olfativos e ultra-sônicos.
- Se uma estirpe conhecida a subir as suas caudas, como C57BL6 / J, está sendo usado Climbstoppers lugar em torno da cauda antes de aplicar a fita.
- Aderir a fita para as caudas de camundongos. Use a ponta da fita marcada e certifique-se da fita adere à cauda e sobre si mesmo. A fita deve ser aplicada até o fim da cauda com 2-3 milímetros de cauda permanecem fora da fita.
- Uma vez que cada pedaço de fita está conectada a uma cauda de rato furar a parte do meio da fita para as paredes internas da gaiola. Isso ajudará a evitar o emaranhado das peças de fita uns aos outros. Note-se que confinement desta forma pode causar estresse e que é importante para completar o processo de aplicar a fita para cada animal o mais rápido possível.
- Uma vez que toda a fita é aplicada, iniciar a gravação e identificar a sessão antes de os ratos estão suspensos.
- Suspender os animais, colocando a extremidade livre da fita na barra de suspensão ou prateleiras em uma ordem que é contrabalançada entre os grupos de tratamento. Suspender os ratos de uma forma que é não obstruir a visão da câmera porque a sessão inteira será TST marcou e obstruindo a câmera vai levar à incapacidade para avaliar comportamentos durante esse tempo. Verifique se todos os fins de fita estão pendurados paralelamente à barra de suspensão ou prateleira com um comprimento similar de folga para cada rato.
- No final da sessão (o que é tipicamente seis minutos), o retorno dos animais ao seu homecage e remova cuidadosamente a fita de cada cauda, puxando-o fora. Não rasgar a fita do rabo pois isso pode causar dor ao microfonee.
- Depois de voltar os ratos para sua sala de colônia descartar a boli fecal e urina a partir das bandejas de coleta e limpe o aparelho com uma solução esterilizante.
3. Análise do Comportamento
- Geralmente, o TST é do início ao fim seis minutos de duração. Ao contrário de outro procedimento amplamente utilizado eficácia antidepressiva, o teste de natação forçada, toda a sessão é marcado. Isto é devido à constatação de que os ratos tendem a imobilidade se manifestar no início do TST.
- Em nosso laboratório nós fazer o upload dos arquivos de vídeo diretamente da câmera para um PC, onde a análise é conduzida.
- Durante a análise do comportamento do tempo que passa cada rato como móveis é medido. Embora seja possível medir o tempo de imobilidade diretamente, nós descobrimos que é mais fácil de detectar e medir movimentos ativos e não a falta de tais movimentos.
- O aspecto mais importante da análise comportamental TST é a identificação consistente de movimentos que são registrados como a mobilidade de boa-fé. Ratos, especialmente no início da sessão, os comportamentos manifesto que são abertamente escapar relacionados. Estes incluem tentando alcançar as paredes do aparelho e na barra de suspensão, forte tremor do corpo, e movimento dos membros semelhante à execução. Estes movimentos constituem claramente mobilidade. Esses comportamentos, em seguida, desaparecer e tornar-se mais sutis. Em movimentos de nosso laboratório de pequeno porte que estão confinados às pernas da frente, mas sem o envolvimento das patas traseiras não são contados como mobilidade. Além disso, as oscilações do pêndulo e como balanços que são devido à dinâmica adquirida durante os ataques de mobilidade anteriores também não são contados como mobilidade.
- Em nosso laboratório usamos um software na tela do cronômetro para a medição do tempo (XNote cronômetro, dnSoft Research Group). Dois cronômetros separados são usados na tela. O cronômetro primeiro faz a contagem regressiva de 360 segundos e alerta o observador quando o período de análise comportamental termina. O segundo stopwatch controlado pelo observador-mede o tempo gasto móvel. Software cronômetro certos tem a capacidade de atribuir teclas para iniciar e parar funções, de modo que na tela o teclado pode controlar o cronômetro. Em vez de um teclado normal, nós usamos um dispositivo de entrada comumente conhecido como um "gamepad" para controlar os cronômetros.
- Se houver mais de um rato testados e apresentar na tela é uma boa idéia para cobrir os outros animais, para que seus movimentos não vai distrair o observador. Isso pode ser feito usando outra janela do programa ou fisicamente cobrindo os outros ratos na tela com papel.
- Pode haver algum viés que ocorre se a quantidade total de tempo decorrido a mobilidade de um mouse especial é visível antes do término da sessão de análise. Se um cronômetro na tela é usado, nós sugerimos para cobrir todas as casas decimais, mas o milésimo de segundo do cronômetro. Cobrindo o cronômetro o observador só sabe se o cronômetro éligado ou desligado a qualquer momento, mas não sabe o tempo total decorrido e, portanto, não pode ser afetada por qualquer preconceito. Usando essa abordagem o observador, enquanto cego para as atribuições do grupo dos animais, não terá uma idéia geral do nível de mobilidade em cada animal.
- Um teste de confiabilidade interobservador deve ser conduzida para cada novo observador antes de começar a coletar dados de animais de laboratório. Em nosso laboratório a cada novo observador primeira assiste a um observador experiente enquanto ele ou ela está marcando. Após a novos observadores ganhar a confiança suficiente para diferenciar a mobilidade da imobilidade, eles então pontuação em tempo real com o observador experiente observando e apontando os erros. Uma vez que esta fase é concluída com êxito, os novos observadores irão analisar um conjunto específico de vídeos TST que mantemos em nosso laboratório para fins de treinamento. Só depois de um alto grau de correlação interobservador é obtido com o observador experiente faz um investigador analisar vídeos do TST realexperimentos. Nós arquivar os dados dessas análises de treinamento para constituir um padrão interno para o laboratório. Temos observado diferenças entre as linhagens na maneira pela qual eles expressam mobilidade (e imobilidade) comportamentos, eo tempo médio de imobilidade entre os sexos. Quando um modelo novo mouse tensão, sexo, ou geneticamente modificados é testado em laboratório é necessário novamente realizar este tipo de análise de confiabilidade.
4. Resultados representante
Temos utilizado o TST para avaliar antidepressivo respostas a tratamento com lítio em várias linhagens de camundongos (Figura 1) 3. Detalhes experimentais desta experiência são publicados em Can et al., 2011 3.
Figura 1. Tempo de imobilidade no teste de suspensão da cauda após a administração de lítio crônica em cinco linhagens de camundongos inbred. Camundongos foram grupo casad, quatro ratos por gaiola. Ratos no grupo de tratamento com lítio receberam ração contendo lítio 4 g / kg LiCl por três semanas. Animais controle receberam alimentos idênticos sem o cloreto de lítio. **: P <0,01, ***: p <0,001 denotam uma significativa, teste t não pareado. Os dados são expressos como média ± SEM. n :10-12 animais por grupo para cada cepa. (Figura reproduzida a partir de 3).
Neste exemplo, um efeito significativo do tratamento crônico de lítio entregues nos alimentos é observada apenas em linhagens C57BL/6J e DBA/2J. Nos outros três cepas, não houve diminuição estatisticamente significativa no tempo de imobilidade foi observada. Estes dados indicam que uma resposta antidepressiva semelhante ao tratamento de lítio tensão crônica é dependente como também tem sido observado com outros antidepressivos medicamentos 4-8.
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Discussion
Desenvolvimento do TST por Steru et al. 9 foi influenciado pela desenvolvidos anteriormente teste de natação forçada 10-12. Semelhante ao teste de natação forçada, no TST ratos são colocados em uma situação inevitável, mas moderadamente estressantes. Falta de comportamento de fuga é considerada relacionadas imobilidade. Como o teste de natação forçada, o TST é um teste validado para a melhor avaliação de eficácia antidepressiva de drogas, mas também usado para avaliar os efeitos do meio ambiente, manipulações neurobiológicas e genéticas 13-18. Em contraste com o teste de natação forçada, no TST não há risco de hipotermia devido à submersão em água 19. Os experimentadores devem ter em mente que, enquanto o teste de natação forçada e TST são prima facie similar, existem várias diferenças importantes em sua sensibilidade e desempenho e os resultados de um teste pode não ser necessariamente replicada no outro. Para uma excelente descrição do b diferençasntre estes dois testes consulte as seguintes referências 4,20,21. Embora a maioria dos antidepressivos levam semanas para exercer efeitos clinicamente significativas em pacientes, os antidepressivos podem exercer seus efeitos no TST e teste de natação forçada tanto seguintes tratamentos agudo e crônico 20,22,23. No entanto, há muitos outros testes comportamentais utilizados para avaliar efeitos do tipo antidepressivo em camundongos que são geralmente sensíveis ao tratamento crônico apenas. Estes incluem o estresse crônico imprevisível 24, stress derrota social 25, ea novidade suprimida alimentação 26.
Além de seu tamanho reduzido, baixo custo e relativa facilidade de configuração, automação de coleta de dados no TST também é possível 9,27,28. Duas abordagens principais para automação são os sistemas eletro-mecânicos de medição e análise de vídeo. Na abordagem eletro-mecânico, o animal é suspenso a partir de um medidor de tensão e os movimentos dos animais são medidos (por exemplo, Med Associates Inc, St. Albans, VT; Harvard Apparatus, Holliston, MA). Outra abordagem é a análise de software baseado em gravações de vídeo TST (por exemplo, Noldus Inc., Países Baixos; Cleversys Inc., Reston, VA). No entanto, mesmo com a automação, a intervenção humana continuará a ser necessário, uma vez que os parâmetros utilizados devem ser ajustados para cada modelo novo mouse ou tensão e os resultados devem ser verificados por um observador humano para fins de controle de qualidade.
Um problema persistente que merece uma atenção especial com o TST é o comportamento da cauda de escalada de alguns ratos, especialmente os usados cepa C57BL / 6 1,20. Estes animais têm uma propensão para alcançar e subir suas próprias caudas. Camundongos que escalar com sucesso as suas caudas aprenderam que é possível escapar. Camundongos, devendo ser excluídos da análise, o que aumenta o número de ratos necessária e diminui a confiabilidade do procedimento. O fato de que a cepa do mouse C57BL / 6 é o mais common cepa utilizada em pesquisas neurobiológicas e genéticas exacerba a influência deste problema. Neste artigo, detalhamos uma solução para a cauda escalada comportamento que foi desenvolvida em nosso laboratório 2,3. A fim de prevenir o comportamento da cauda de escalada, colocamos cilindros ocos ao redor da base da cauda de camundongos. Os ratos não podem prender em tais garrafas e, portanto, não pode subir as suas caudas. Temos observado que nenhum ratos subiram suas caudas quando se utiliza esta abordagem 2,3. Além disso, temos mostrado que os efeitos antidepressivos do tipo de lítio, relatado anteriormente no TST sem esses tipos de cilindros de 29, ainda estão presentes quando usá-los 3.
Note-se que o TST não é recomendado para roedores mais pesados, como ratos, uma vez que é potencialmente dolorosa para estes animais para suportar seu peso apenas por suas caudas. Da mesma forma, o cuidado deve ser tomado com ratos excepcionalmente pesados (por exemplo, ratos usados paraobesidade modelagem), e, nestes casos, os experimentadores deve olhar para testes alternativos, como o teste de natação forçada 10 Deve-se ter em mente que quaisquer manipulações que podem afetar os níveis de atividade global pode potencialmente alterar a mobilidade no TST levando a conclusões falsas. Devido a isso, é importante verificar os resultados do TST com separado testes comportamentais que medem os níveis de atividade geral em camundongos como o teste de campo aberto 30.
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Disclosures
Autores declaram que não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo NIHM conceder R01 e R21 MH091816 MH084043 para TDG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tape | |||
| Timer | |||
| Video Camera | |||
| White Noise Generator (optional) | |||
| Climbstoppers (optional; depending upon strain used) |
References
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