Summary
Хвост-подвески тест проверяется как экспериментальная процедура оценки антидепрессивной эффективности лекарственной терапии у мышей. Мыши подвешены за хвосты в течение шести минут и избежать поведения, связанного оцениваются. Мы описываем процедуры, используемые при проведении испытаний хвостом подвески.
Abstract
Хвост-подвески тест мыши поведенческих тестов полезно в отбора потенциальных антидепрессантов, а также оценки других манипуляций, которые, как ожидается, повлияет депрессии связано поведение. Мыши подвешены за хвосты с лентой, в таком положении, что она не может убежать или держаться на близлежащие поверхности. Во время этого теста, как правило, шесть минут по продолжительности, в результате побега ориентированного поведения количественно. Хвост-подвески тест является ценным инструментом в лекарственных препаратах для высокопроизводительного скрининга перспективных антидепрессант соединений. Здесь мы описываем детали, необходимые для реализации этого теста с дополнительным акцентом на возможные проблемы, которые могут возникнуть и как их избежать. Мы также предлагаем решения хвост восхождение поведения, общая проблема, которая делает этот тест бесполезно в некоторых штаммов мыши, такие, как широко используется C57BL / 6. В частности, мы предотвращаем хвост восхождение поведения, передавая мыши хвосты через маленькие пластмассовыецилиндра до приостановления. Наконец, мы подробно, как вручную оценка поведения, которые проявляются в этом тесте.
Protocol
1. Материалы
1. Подвеска Box
Хвост-подвески теста (TST) включает в себя приостановление мыши над землей за хвосты. На самом базовом уровне, процедура требует только бар приостановлении или полки выступа, и ленты. Тем не менее, экспериментатор должен рассмотреть вопрос об использовании фон, который обеспечивает оптимальную контрастность. Кроме того, целесообразно принять меры, чтобы предотвратить мышей от соблюдения других животных, которые проходят испытания. В нашей лаборатории мы используем специально изготовленные хвостом подвески коробки (четыре-часовой рабочий день, Балтимор MD), изготовленных из пластика с размерами (55 х высота 60 ширина х 11,5 см глубины). В целях предотвращения животных от наблюдения или взаимодействующих друг с другом, каждая мышь приостановлено в пределах своей собственной три стенками прямоугольного отсек (55 X 15 высота ширина х 11,5 см глубины). Мышь приостановлено в середине этого отсека и ширине и глубине достаточно размера, чтобы мышь не может сделать сотрудничествоntact со стенами. В этих условиях приблизительное расстояние между носом мышки и аппарат пола составляет 20-25 см. Есть четыре таких идентичны отсеки в аппарате позволяет нам тестировать четыре мышей одновременно. Бар алюминиевые подвески (1 см. Высота х 1 см. Ширину х 60 см. Длины), используется для приостановки хвосте каждой мыши, расположен на верхней части коробки. Размеры, которые мы используем в нашей лаборатории, следует рассматривать как общую справочную информацию. Например, размер отдельных отсеков хвостовой подвески коробки может быть увеличена, если большая нагрузка беспородных мышей (например, CD-1) не используется.
В нижней части каждого отсека мы размещаем съемный лоток алюминия, который собирает кала или мочи животных. Мы используем темно серый квадрат на альбиноса животные и кремового цвета коробки для мышей других цветов шерсти. Такое расположение дает нам лучшую контрастность и поэтому более надежна поведенческих озвучивание тест.
2. Лента
3. Таймер
4. Устройство видеозаписи
Видеокамера и штатив (или другие структуры поддержки) не требуется. Так как этот тест обычно включает в себя несколько животных проходит испытания в то же время, жить забив будет трудным и не рекомендуется. Видеокамера должна записи в приветGH достаточное разрешение для отображения качества изображения, которое будет использоваться в дальнейшем для поведенческого скоринга. Всегда убедитесь, что имеется достаточно памяти, запись в камере перед началом теста. Мы используем видео-камеры, которые в электронном формате без использования физических носителей (например, видео-кассета), что позволяет просто передача видео.
5. Белый шум генератора
Генератор шума должен маски прерывистый звуки окружающей среды. Использование генератора шума особенно рекомендуется в лабораторных условиях, где внезапный громкий шум можно услышать, что потенциально могло бы напугать мышей. В нашей экспериментальной комнате уровень окружающего шума (без генератором белого шума активирована) составляет около 60 дБ. Общий уровень звука с генератором белого шума активируется в месте, где TST проводится в 70-72 дБ. Тем не менее, следует отметить, что эти цифры приведены в качестве примера только, и каждая лаборатория должна выбратьПраво уровней шума в соответствии с их уникальной окружающей среды и обстоятельств.
6. Средства для чистки
Подвески коробка должна быть уничтожена полностью после каждой сессии с стерилизации раствора (например, MB-10, Quip Laboratories, Inc, Уилмингтон, Делавэр, и т.п.).
7. Climbstoppers (опционально: зависит от штамма используется)
Мыши некоторых фонов, таких как C57BL / 6, могут подняться хвосты во время теста 1. Очистить полых цилиндров (4 см в длину, 1,6 см наружный диаметр, 1,3 см в диаметре, 1,5 грамма), которые разрезают на четыре см в длину (по FourHourDay Inc, Балтимор MD) из труб поликарбоната (# 8585K41, McMaster-Carr, Санта-Фе-Спрингс , Калифорния) расположены вокруг хвостов мышей, чтобы предотвратить такое поведение хвоста восхождения 2,3. Эти устройства могут быть выполнены в любой лаборатории с обычных инструментов и материалов.
2. Поведенческие процедур
- Поместите фотокамеру в нужном положении. Камера должна быть как можно ближе, чтобы получить максимально возможное разрешение животных.
- Лента фрагменты, которые будут использоваться во время сессии должны быть сокращены, маркировано и подготовлен к сессии.
- Начало генератором белого шума, если используется, прежде чем мышей знакомятся с тестирования комнате. Уровень белого шума должен только быть достаточно, чтобы замаскировать внешние шумы. Избегайте большого объема и убедитесь, что такой же уровень белого шума используется для всех животных.
- Принеситеimals в тестировании комнате. Если комната, где животные живут и тестирования комнате рядом друг с другом с аналогичным условиям окружающей среды, без акклиматизации срок может быть необходимо. В противном случае, место животных в тестировании возможностей для периода акклиматизации (как правило, не менее одного часа). Помните, что другие животные помещаются в одной комнате может ощутить обонятельные и ультразвуковые сигналы.
- Если напряжение известно, чтобы подняться хвосты, такие как C57BL6 / J, используется месте Climbstoppers вокруг хвосты перед нанесением ленты.
- Придерживайтесь ленты хвосты мышей. Используйте отмечен конец ленты и убедитесь, что лента приклеивается к хвосту и обратно на себя. Лента должна быть применена к самому концу хвост с 2-3 миллиметров хвоста, остающихся вне ленты.
- Как только каждый кусок ленты крепится к мыши хвост палкой средней части ленты на внутренних стенках клетки. Это поможет избежать запутывания ленты частей друг к другу. Заметим, что сonfinement таким образом может вызвать стресс и, что важно, чтобы завершить процесс применения ленты для каждого животного, как только возможно.
- После того как все Лента применяется, начать запись и определить сессии до мышей приостановлены.
- Приостановить животных, поместив свободный конец ленты на панели подвеской или на полке в порядке, который уравновешивается между группами лечения. Приостановить мышей таким образом, чтобы это не создавало препятствий камеры, потому что вся сессия TST будет забито и препятствует камеры приведет к невозможности оценить поведение в это время. Убедитесь, что все ленты концы висят параллельно бар приостановлении или полку с аналогичной длиной слабину для каждой мыши.
- В конце сессии (которая, как правило шести минут), возвращение животных в их homecage и осторожно удалите ленту с каждого хвоста, осторожно потянув ее. Не сорвать ленту с хвоста так как это может вызвать боли в микрофонe.
- После возвращения мышей, чтобы их колонии комнату отказаться от фекальных Боли и мочи из коллекции лотки и протрите аппарат с стерилизации решение.
3. Анализ поведения
- Как правило, TST является от начала до конца шесть минут в длину. В отличие от другого широко используется антидепрессант процедуры эффективность, вынуждены плавать теста, весь сеанс забил. Это связано с общий вывод, что у мышей, как правило, проявляются неподвижность ранее в TST.
- В нашей лаборатории мы загружать видео-файлы непосредственно с камеры на компьютер, где проводится анализ.
- В поведенческом анализе времени, что каждый мышь тратит как мобильные измеряется. Хотя вполне возможно, для измерения времени неподвижности напрямую, мы нашли ее легче обнаружить и измерить активных движений, а не отсутствие такого движения.
- Наиболее важным аспектом TST поведенческого анализа является последовательное выявление движенияов, которые регистрируются в качестве добросовестных мобильности. Мыши, особенно в начале сессии, проявлять поведение, которое открыто избежать связаны между собой. К ним относятся пытаются достичь стен аппарата и подвески бар, сильным сотрясением тела, и движения конечностей сродни работает. Эти движения, несомненно, являются мобильность. Такое поведение, то стихают и становятся тоньше. В нашей лаборатории небольшие движения, которые ограничены передними ногами, но без участия задние ноги, не учитываются как мобильность. Кроме того, колебания и маятник, как качели, которые из-за импульс, полученный в ходе предыдущих боев мобильности также не учитываются, как мобильность.
- В нашей лаборатории мы используем на экране секундомер программное обеспечение для измерения времени (XNote секундомер, dnSoft Research Group). Два отдельных секундомеров, используемых на экране. Первый секундомер отсчитывает от 360 секунд и оповещения наблюдателя при анализе поведенческих период заканчивается. Второй стоpwatch-контролируемой наблюдателями мерах время, проведенное мобильного телефона. Некоторые программы секундомер имеет возможность назначать ключи для запуска и остановки функций, так что на экране клавиатуры могут управлять секундомер. Вместо обычной клавиатуры, мы используем устройства ввода широко известный как "геймпад" для управления секундомеры.
- Если есть больше чем одна мышь проверены и присутствует на экране, это хорошая идея, чтобы покрыть другие животные, так что их движение не будет отвлекать наблюдателя. Это может быть достигнуто с помощью другой программы окна или физически покрытие других мышей на экране с бумагой.
- Там могут быть некоторые смещения, происходящие, если общее количество времени, прошедшего мобильности для конкретной мыши видна до завершения анализа сессии. Если на экране секундомер используется, мы предлагаем, чтобы охватить все, но миллисекунды десятичные дроби из секундомер. Прикрывая секундомер наблюдатель знает ли секундомерили выключить в любой момент, но не знает общее время прошло, и поэтому не может зависеть от какой-либо предвзятости. Используя этот подход наблюдателя, в то время закрывать глаза на групповых заданий животных, не будет иметь общее представление о уровень мобильности у каждого животного.
- Тест interobserver надежность должна проводиться для каждого нового наблюдателя, прежде чем начать собирать данные из подопытных животных. В нашей лаборатории каждый новый наблюдатель первые часы опытный наблюдатель, пока он или она забил. После новых наблюдателей получить достаточную уверенность, чтобы отличать мобильность от неподвижности, они тогда счет в режиме реального времени с опытным наблюдателем заниматься указывая на ошибки. Как только этот этап успешно завершен, новых наблюдателей будет анализировать определенный набор TST видео, которые мы поддерживаем в нашей лаборатории в учебных целях. Только после того, высокий уровень interobserver корреляция полученных опытный наблюдатель делает следователя анализировать TST видео с фактическимэкспериментов. Мы архива данных из этих учебных анализов, чтобы составить внутренний стандарт для лабораторий. Мы наблюдали различия между штаммами в порядке, в котором они выражают мобильности (и неподвижности) поведения, и означает неподвижность времени между полами. Когда новый штамм мыши, пола или генетически модифицированная модель тестируется в лаборатории необходимо снова провести этот тип анализа надежности.
4. Представитель Результаты
Мы использовали TST для оценки антидепрессантом, как ответы на литий лечения в различных линий мышей (рис. 1) 3. Экспериментальные детали этого эксперимента опубликованы в Кан и соавт., 2011 3.
Рисунок 1. Неподвижность время в тестовом хвост суспензии после длительном приеме лития в пяти инбредных линий мышей. Мышей группы домег, четыре мыши в клетке. Мышей в группе лечения лития получил литий чау, содержащий 4 г / кг LiCl в течение трех недель. Контрольные животные получали идентичный пищу без хлорида лития. ** Р <0,01, ***: р <0,001 обозначают значительные, непарный т-тест. Данные представлены в виде среднего ± SEM. н :10-12 животных в каждой группе для каждого штамма. (Рисунок воспроизведен из 3).
В этом примере, существенного влияния лечения хронических лития доставлен в пище наблюдается только в C57BL/6J и DBA/2J штаммов. В трех других штаммов, не статистически значимое снижение неподвижность времени не наблюдалось. Эти данные свидетельствуют о том, что антидепрессанты, как ответ на хроническое лечение лития напряжение зависимой как это наблюдалось и с другими антидепрессантами 4-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Развитие TST по Steru и др. 9. Находился под влиянием разработанной ранее вынуждены плавать тест 10-12. Как и вынуждены плавать испытания, в TST мышей находятся в неизбежной, но умеренно стрессовой ситуации. Отсутствие избежать поведения, связанного считается неподвижности. Как вынужден плавать тест, TST является тестом лучших утверждены для оценки антидепрессивной эффективности лекарственных средств, но также используется для оценки влияния окружающей среды, нейробиологических и генетических манипуляций 13-18. В отличие от вынуждены плавать испытания, в TST нет риска переохлаждения из-за погружения в воду 19. Экспериментаторы должны иметь в виду, что в то время как тест вынуждены плавать и TST похожи на первый взгляд, Есть различные важные различия в их чувствительности и производительности и результатов одного теста не обязательно может быть воспроизведена в другом. За превосходное описание б различияetween этих двух тестах видим следующие ссылки 4,20,21. Хотя большинство антидепрессантов занять несколько недель, чтобы оказать клинически значимых эффектов у пациентов, антидепрессанты могут оказывать свое воздействие в TST и заставили плавать проверить и при остром и хроническом лечение 20,22,23. Тем не менее, Есть много других поведенческих тестов, используемых для оценки антидепрессивной-подобных эффектов у мышей, которые, как правило, чувствительны к хронической очистки. К ним относятся хронический стресс непредсказуемой 24, социальный стресс поражение 25, и новизна подавлено кормления 26.
В дополнение к его небольшой размер, низкая стоимость и относительная простота настройки, автоматизации сбора данных в TST также возможно 9,27,28. Два основных подхода для автоматизации электромеханических систем измерения и видеоанализа. В электро-механический подход, животное отстранен от тензодатчика и движений животных измеряются (например, Mред Associates Inc, Сент-Олбанс, VT; Гарвардского Аппарат, Holliston, MA). Другим подходом является программный анализ TST видеозаписи (например, Noldus Inc, Нидерланды; Cleversys Inc, Рестон, Вирджиния). Однако даже при автоматизации, вмешательство человека все равно будет необходимо, так как применяются параметры должны быть отрегулированы для каждой новой модели мыши или напряжение и результаты должны быть проверены человека-наблюдателя за качество целей контроля.
Один постоянная проблема, которая заслуживает особого внимания с TST есть хвост-альпинизм поведение некоторых мышей, особенно часто используемые C57BL / 6, напряжение 1,20. Эти животные имеют склонность к доставая и восхождение свои хвосты. Мыши, которые успешно подняться хвосты узнали, что возможно убегание. Такие мыши должны быть исключены из анализа, который увеличивает количество мышей требуется, и снижается надежность процедуры. Тот факт, что штамм C57BL / 6 мышь с наиболееommon штамм используется в нейробиологических и генетических исследований усугубляет влияние этой проблемы. В этой статье мы подробно решение хвост-альпинизм поведения, который был разработан в нашей лаборатории 2,3. В целях предотвращения хвост-альпинизм поведения, мы помещаем полых цилиндров вокруг основания хвоста мышей. Мышей не может держаться на эти цилиндры и, следовательно, не могут подняться их хвостов. Мы наблюдали, что ни мышей поднялись хвосты при использовании этого подхода 2,3. Кроме того, мы показали, что антидепрессант-подобных эффектов лития, сообщили ранее в TST без этих типов цилиндров 29, по-прежнему присутствуют при их использовании 3.
Следует отметить, что TST не рекомендуется для более тяжелых грызунов, таких как крысы, так как это потенциально болезненным для этих животных, чтобы выдержать их вес только их хвостов. К тому же, следует проявлять осторожность с необычно тяжелыми мыши (например мыши используется длямоделирование ожирение), и в этих случаях экспериментаторы должны искать альтернативные тесты, такие как принудительное плавание тест 10 Следует иметь в виду, что любые манипуляции, которые могут повлиять на общий уровень активности может потенциально изменить подвижность в TST ведущий к ложным выводам. Из-за этого, важно, чтобы проверить результаты TST с отдельными поведенческие тесты, которые измеряют общий уровень активности у мышей, таких как открытые полевые испытания 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом NIHM R01 и R21 MH091816 MH084043 к ПОГ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tape | |||
| Timer | |||
| Video Camera | |||
| White Noise Generator (optional) | |||
| Climbstoppers (optional; depending upon strain used) |
References
- Mayorga, A. J., Lucki, I. Limitations on the use of the C57BL/6 mouse in the tail suspension test. Psychopharmacology (Berl). 155, 110-112 (2001).
- Dao, D. T. Mood Disorder Susceptibility Gene CACNA1C Modifies Mood-Related Behaviors in Mice and Interacts with Sex to Influence Behavior in Mice and Diagnosis in Humans. Biological Psychiatry. 68, 801-810 (2010).
- Can, A. L. Antidepressant-like responses to lithium in genetically diverse mouse strains. Genes, Brain and Behavior. 10, 434-443 (2011).
- Bai, F., Li, X., Clay, M., Lindstrom, T., Skolnick, P. Intra- and interstrain differences in models of "behavioral despair". Pharmacol. Biochem. Behav. 70, 187-192 (2001).
- Cervo, L. Genotype-dependent activity of tryptophan hydroxylase-2 determines the response to citalopram in a mouse model of depression. J. Neurosci. 25, 8165-8172 (2005).
- David, D. J., Renard, C. E., Jolliet, P., Hascoet, M., Bourin, M. Antidepressant-like effects in various mice strains in the forced swimming test. Psychopharmacology (Berl). 166, 373-382 (2003).
- Dulawa, S. C., Holick, K. A., Gundersen, B., Hen, R. Effects of chronic fluoxetine in animal models of anxiety and depression. Neuropsychopharmacology. 29, 1321-1330 (2004).
- Lucki, I., Dalvi, A., Mayorga, A. J. Sensitivity to the effects of pharmacologically selective antidepressants in different strains of mice. Psychopharmacology (Berl). 155, 315-322 (2001).
- Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology (Berl). 85, 367-370 (1985).
- Can, A., Dao, D. T., Arad, M., Terrillion, C. E., Piantadosi, S. C., Gould, T. D. The Mouse Forced Swim Test. J. Vis. Exp. 58, 3791-3638 (2012).
- Porsolt, R. D., Bertin, A., Jalfre, M. Behavioral despair in mice: a primary screening test for antidepressants. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 229, 327-336 (1977).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioural despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments. Eur. J. Pharmacol. 47, 379-391 (1978).
- Crowley, J. J., Blendy, J. A., Lucki, I. Strain-dependent antidepressant-like effects of citalopram in the mouse tail suspension test. Psychopharmacology (Berl). 183, 257-264 (2005).
- Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415, 197-201 (2001).
- Lad, H. V., Liu, L., Paya-Cano, J. L., Fernandes, C., Schalkwyk, L. C. Quantitative traits for the tail suspension test: automation, optimization, and BXD RI mapping. Mammalian. Genome. 18, 482-491 (2007).
- Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biol. Psychiatry. 49, 575-581 (2001).
- Ripoll, N., David, D. J., Dailly, E., Hascoet, M., Bourin, M. Antidepressant-like effects in various mice strains in the tail suspension test. Behav. Brain. Res.. 143, 193-200 (2003).
- Mineur, Y. S., Belzung, C., Crusio, W. E. Effects of unpredictable chronic mild stress on anxiety and depression-like behavior in mice. Behav. Brain. Res. 175, 43-50 (2006).
- Thierry, B., Stéru, L., Simon, P., Porsolt, R. D. The tail suspension test: Ethical considerations. Psychopharmacology. 90, 284-285 (1986).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 29, 571-625 (2005).
- O'Leary, O. F., Cryan, J. F. Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice. Gould, T. D. 42, Humana Press. 119-137 (2009).
- Detke, M. J., Johnson, J., Lucki, I. Acute and Chronic Antidepressant Drug Treatment in the Rat Forced Swimming Test Model of Depression. Experimental and Clinical Psychopharmacology. 5, 107-112 (1997).
- Rupniak, N. M. J. Animal models of depression: challenges from a drug development perspective. Behavioural Pharmacology. 14, 385-390 (2003).
- Strekalova, T., Steinbusch, H. Mood and Anxiety related phenotypes in mice: Characterization using behavioral tests. 42, 153-176 (2009).
- Bartolomucci, A., Fuchs, E., Koolhaas, J. M., Ohl, F. Mood and Anxiety related phenotypes in mice: Characterization using behavioral tests. 42, 261-275 (2009).
- Samuels, B. A., Hen, R. Mood and Anxiety related phenotypes in mice: Characterization using behavioral tests. 63, 107-121 (2011).
- Juszczak, G. R. The usage of video analysis system for detection of immobility in the tail suspension test in mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 85, 332-338 (2006).
- Crowley, J. J., Jones, O. 'L. eary, F, O., Lucki, I. Automated tests for measuring the effects of antidepressants in mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 78, 269-274 (2004).
- Gould, T. D. Involvement of AMPA receptors in the antidepressant-like effects of lithium in the mouse tail suspension test and forced swim test. Neuropharmacology. 54, 577-587 (2008).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and Anxiety related phenotypes in mice: Characterization using behavioral tests. Gould, T. D. 42, Humana Press. (2009).
