Summary
قد كشف في وقت مبكر من موت الخلايا المبرمج الخلية تحديد السكان المعرضين للخطر في مجموعة متنوعة من الأمراض. هنا نحن يبرهن على وجود طريقة لربط موت الخلايا المبرمج في وقت مبكر للكشف عن البروتين (Annexin V) على جزيئات النانو أكسيد الحديد المغناطيسي للكشف (SPIO). ويجوز تمديد هذه الطريقة إلى البروتينات الأخرى ذات الاهتمام لتوليد التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف تحقيقات التصوير الجزيئي.
Abstract
موت الخلايا المبرمج الخليوي هي سمة بارزة من كثير من الأمراض، وهذا موت الخلايا المبرمج يحدث عادة قبل المظاهر السريرية للمرض واضحة للعيان. وثمة وسيلة للكشف عن موت الخلايا المبرمج في مراحله المبكرة، عكسها تحمل ما قبل السريرية 'نافذة' خلالها يمكن اتخاذ تدابير وقائية أو علاجية لحماية القلب من ضرر دائم. نقدم هنا طريقة بسيطة وقوية لتصريف الإنسان Annexin الخامس (ANX)، الذي يربط بشوق إلى الخلايا في المراحل المبكرة، عكسها من موت الخلايا المبرمج، على جزيئات حديد superparamagnetic (SPIO) أكسيد، والتي تكون بمثابة وكيل النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف. طريقة اقتران يبدأ أكسدة النانوية SPIO، التي يكسد مجموعات الكربوكسيل على قذيفة السكاريد من SPIO. تنقية ANX البروتين ثم يضاف في الإعداد للصوديوم بورات حل لتسهيل التفاعل التساهمية من ANX مع SPIO في منطقة عازلة الحد. خطوة تخفيض نهائي مع borohydrid الصوديوميتم تنفيذ ه لاستكمال الحد من الفقر، ومن ثم تطفئ رد الفعل. تتم إزالة ANX Unconjugated من المزيج عن طريق الترشيح microcentrifuge. يتم التحقق من حجم ونقاء المنتج ANX-SPIO التي تشتت الضوء الحيوي (DLS). هذا الأسلوب لا يتطلب بالإضافة إلى، أو تعديل، والسكاريد SPIO قذيفة، في مقابل عبر ربط طرق الحديد أكسيد اقتران الجسيمات النانوية أو البيوتين المسمى. ونتيجة لذلك، وهذه الطريقة يمثل بسيطة، ونهج القوية التي يمكن تمديدها إلى اقتران من البروتينات الأخرى ذات الاهتمام.
Protocol
مقتبس من الدراسة قبل 1.
1. اقتران الخامس Annexin إلى SPIO
- أكسدة جزيئات SPIO (المحيط تكنولوجيا النانو وشركة، 5 ملغ / مل) لمدة 1 ساعة على 20 درجة مئوية في الظلام في حل مع 0.15 بريودات الصوديوم M (NaIO 4) (4:01 الوزن: نسبة الوزن) 2.
- احتضان SPIO أكسدة لمدة 12 ساعة مع تنقيته ANX البروتين (نسبة 1:1، الوزن: الوزن) في 0.15 متر بورات الصوديوم (نا 2 B 4 O 7 10H 2 O) في 20 درجة مئوية
- الحد من خليط أخرى ل1 ساعة مع بوروهيدريد الصوديوم (NABH 4) تحت غطاء محرك السيارة والدخان ثم سقى مع 0.15 متر تريس، حمض الهيدروكلوريك.
- فصل ANX خالية من ANX-SPIO بواسطة الطرد المركزي في 14000 XG (75 ميكرون المسام Microcon مرشح، ميليبور، فالجهاز يبث اشعة تماثل، MA).
- مزيد من التنقيح للمجمع عن طريق إزالة الشوائب غير منضم باستخدام جهاز الفاصل المغناطيسي (المحيط تكنولوجيا النانو، وشركة).
- قياس retentate فلتر (ANX-SPIO) مستويات البروتينبواسطة فحص بروتين برادفورد ومخزن في -80 درجة مئوية في 2 ملغ / مل في 0.1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك مع مثبطات المصل بنسبة 1٪ والزلال البروتيني (وقف مثبط للبروتياز، الحرارية العلمية، 1-50 ملغ / ANX ملغ).
2. ديناميكية تشتت الضوء
- تمييع بشكل منفصل SPIO وANX SPIO في برنامج تلفزيوني لكثافة بصرية من 0.1 وتحليل من قبل تناثر ضوء دينامية في جهاز Zetasizer DLS نانو (مالفيرن شركة، ورسيستيرشاير، المملكة المتحدة) 3.
- الحصول على قمم monomodal (المثالية) للمجمع، مع حجم الجسيمات Z-المتوسط، ومؤشر التشتت المتعدد (PDI). قارن هذا الحجم إلى حجم DLS قياسها من جسيمات متناهية الصغر أكسيد الحديد وحدها. وأظهرت النتائج SPIO ANX-DLS 1 الهيدروديناميكية الجسيمات القطر المتقارن من 78 نانومتر مع PDI 0.13 1، وهو ما يعكس متجانسة ANX-SPIO الأنواع 3.
3. الثقافة الخلية، الحث على موت الخلايا المبرمج في الثقافة، والتصوير بالرنين المغناطيسي من الخلايا المستزرعة
- ثقافة عظم فأر بالغ نخاع الوسيطة قتستكمل الخلايا تيم (mMSCs) في DMEM مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (إينفيتروجن، وشركة)، ويفضل في مرور 20-30 أبريل.
- تحفز الخلايا في الخلايا الثقافة عن طريق علاج لفترات مختلفة على 37 درجة مئوية مع أيام سينما الواقع DOX (سيغما، 1 ملم في المياه المالحة 0.9٪، 1 ميكرومتر تركيز في وسائل الاعلام) 12.
- قياس كمية من موت الخلايا المبرمج في ثقافة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي مع ANX-SPIO (الوارد وصفها في 3.4 أدناه) أو باستخدام المجهر بعد صمة عار TUNEL (APO-BrdUTM أدوات الفحص TUNEL، المسابر الجزيئية / إينفيتروجن، يوجين، OR) أو بعد وصمة عار مع ANX-FITC (روش، سويسرا).
- تسمية الخلايا مع ANX-SPIO (10 ملغ بروتين / مل المتوسطة باستثناء كما ورد)، أو مع الوزن يعادل SPIO حرة (5 ملغ)، لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. غسل 4 مرات مع برنامج تلفزيوني، وتراكب مع 1 مل من الاغاروز 1٪ لمنع انتشار جزيئات SPIO. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي من الأطباق (موضح أدناه). بدلا من ذلك، وغسل الخلايا ويعرض للتريبسين بعد أيام سينما الواقع DOX ووضع العلامات ANX-SPIO، ثم السماح للخلايا إلىتشكل الكريات في أنابيب إيبندورف.
4. في المختبر التصوير بالرنين المغناطيسي
- استخدام 1.5 أو 3 تسلا EXCITE Signa GE الماسح الضوئي مع مستوى الركبة لفائف المتلقي لتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي في المختبر.
- وضع أطباق ثقافة أو أنابيب الى شبح أجار، والصورة باستخدام التدرج الصدى تسلسل التدرج مدلل: دوام التكرار (TR) 550 مللي، صدى الوقت (TE) 10 مللي، وزاوية الوجه 15 درجة، مصفوفة 256 × 256، الميدان من رأي 3 سم × 3 سم، سماكة 1.3 مم شريحة، وعدد من المتوسطات (NEX) 2، والمباعدة بين 0 5 مم. صورة محوريا من خلال طبقة الخلية على لوحة لخسارة T2 إشارة *، وذلك باستخدام المناطق في المصالح (رويس) من منطقة محددة (على سبيل المثال، 0.8 مم 2). ضبط الخلفية باستخدام مراقبة عائدات الاستثمار إشارة من شبح أجار. قياس الضوضاء في الخلفية من إشارة من الهواء المحيط الوهمية.
- حساب التباين التصوير بالرنين المغناطيسي إلى الضجيج نسبة (لجنة المصالحة الوطنية: [SI عينة العائد على الاستثمار ROI-SI سيطرة] / [SD من SI من الضوضاء في الخلفية]، حيث SI هو كثافة الإشارة، وتم احتساب قيمة الانحراف المعياري SD هو) لكل طبق الثقافة.
5. ممثل النتائج
قياس خسارة T2 إشارة * في المختبر يتطلب الوهمية أجار متجانسة وعدم وجود فقاعات الهواء، والتي سوف تخلق قطعة أثرية إشارة لاغية. هذه الأداة من الصعب تمييزها عن الحقيقية T2 فقدان إشارة * من SPIO، وأمر بالغ الأهمية لتفسير النتائج. الرجاء انظر الشكل 1 للحصول على مثال قطعة أثرية الهواء، فضلا عن أكسيد الحديد حقيقي T2 فقدان إشارة *.
في المختبر لثقافة التصوير طبق، تطبيق حجم مناسب من هلام أجار إلى كل طبق والثقافة، وبحيث يمكن تقديم ما يكفي من الشرائح المحورية التصوير بالرنين المغناطيسي، والتي هي حوالي 1 مم، إلى صورة وافية طبق كامل. ويوضح الشكل 2 إشارة المتوقعة التصوير بالرنين المغناطيسي من لوحات ثقافة الفرد في أجار. هناك عادة بعض الاختلاف إشارة على حواف الصفيحة، وذلك من تحليل مناطق مادباوينبغي تجنب erest هذه المجالات متفاوت.
الشكل 1. ANX-SPIO بالكشف عن الخلايا العضلية في مثقف الفئران حديثي الولادة. الشكل 1A يظهر صورة لحديثي الولادة العضلية مكعبات تعامل مع حل التحكم (أنبوب إلى اليسار)، ANX-SPIO (وسط أنبوب)، وأيام سينما الواقع DOX + ANX-SPIO (أنبوب اليمين) . لاحظ اللون البني من أيام سينما الواقع DOX + ANX-SPIO الخلايا المعالجة، والتي تعكس زيادة احتفاظ المجمع ANX-SPIO في خلايا أفكارك. الشكل 1B في صور الرنين المغناطيسي في المختبر تبين مكثفة إشارة * T2 فقدان الخلايا أيام سينما الواقع DOX ANX-SPIO +. أيضا، وينظر الى فقاعة هواء في الفترة الواقعة بين 4 و 5 عشر إيبندورف أنابيب (صغير باطل إشارة الأسود)، الذي يشبه الفراغ إشارة من ANX-SPIO، والتي يمكن أن تؤثر على تحليل لجنة المصالحة الوطنية.
الشكل 2. ANX-SPIOملزم غير محدد للخلايا أفكارك في الثقافة. 2A الشكل يوضح العضلية الفئران أفكارك حديثي الولادة في أطباق والثقافة، وتعرض لتلطيخ ANX-FLUOS أو ANX SPIO تلطيخ، مع التركيزات المنخفضة والعالية (اليسار واليمين، على التوالي) من ANX-SPIO. لاحظ مختلف T2 * فقدان إشارة (إشارة الأسود) من الخلايا أفكارك التي تم تناولها مع ANX فلوري (ANX-FLUOS) ومستويات منخفضة مقابل ارتفاع مستويات ANX-SPIO. وزيادة T2 يرتبط * فقدان إشارة على اليمين مع إشارة ANX-FLUOS انخفضت بشكل ملحوظ، والتي تم تنافست قبالة عن طريق تركيزات أعلى ASX-SPIO. الشكل 2B يوضح ملزم التنافسية للANX-SPIO مقابل إشارة ANX-FLUOS والتفكك في ثابت، ك ط. على المحور السيني يدل على تركيز البروتين Annexin في نطاق السجل.
فيلم 1. انقر هنا لعرض إضافيفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة تصريف الافعال المذكورة لربط SPIO إلى الخامس Annexin تستغل جماعات أمين جانب سلسلة من Annexin والأنصاف الكربوكسيل من nanoparticle SPIO. من خلال خطوات محددة للحد من أكسدة، لا يمكن تحقيق الربط التساهمية من هذه المركبات، ويمكن أن تكون معزولة عن جسيمات متناهية الصغر الناتجة functionalized. هذا الأسلوب قد تكون معممة على البروتينات وغيرها من الجسيمات النانوية في المصالح.
الخطوات الأكثر أهمية هي الشروط والحد من أكسدة، التي نفذت في درجات الحرارة المناسبة والاختلاط مع لطيف. قد يؤدي انخفاض العائد من أكسدة غير كاملة أو الحد منها، والذي ينتج المتبقية الخامس Annexin الحرة التي يتم إزالتها أثناء خطوة الترشيح. عندما يطبق على البروتينات الأخرى ذات الاهتمام، قد الظروف المثلى تختلف عن تلك المذكورة أعلاه. ومع ذلك، مرة واحدة وتعرف تلك الظروف المثلى، قد تمت تصفيتها بروتين الحرة إلى تقليص كمية لا تكاد تذكر، وبالتالي، microcentrifuge م الترشيحAY تصبح زائدة عن الحاجة. في الواقع، قد خفض فائض التصفية النهائية العائد مركب بسبب ملزم غير محدد للمرشح نفسه. إذا حدث هذا، قبل تصفية 1٪ والألبومين من خلال مرشح خفض ملزم غير محدد من مجمع مترافق مع مرشح وتحسين الإنتاجية. DLS تحليل مركب النهائي، وكذلك قياسات تركيز البروتين من الترشيح، وسوف تساعد على تحديد ما إذا كان البروتين الحرة المتبقية موجودة.
وجود SPIO مجانا في مجمع النهائي هو أيضا أحد الملوثات المحتملة. تحقيقا لهذه الغاية، كان يعمل DLS للتحقق من النقاء. ذروة monomodal من قبل دائرة الأراضي والمساحة يساعد على ضمان أكسيد الحديد المفرد الأنواع. حر SPIO تنتج وحدها ذروة DLS متميزة في 46nm ولم يكن موجودا في ANX-SPIO الاستعدادات.
عدة خيارات لbioconjugation هي 6-12 المتاحة التي توظف آليات بديلة التصريف، مثل البيوتين streptavidin تفاعل أو بروتين عبر ربط غير متوفر حسب الطلبnoparticles. الطريقة الواردة في هذه الوثيقة تمثل قوي، نهج المطبقة على نطاق واسع لاقتران الجسيمات النانوية المغناطيسية للبروتينات ذات الاهتمام، من دون استخدام جزيئات متخصصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المعاهد الوطنية للصحة، NHLBI (RD، PY، PS).
جمعية القلب الأميركية (JL).
جامعة ستانفورد، VPUE غرانت (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
