Summary
La diagnosi precoce di apoptosi può identificare a rischio le popolazioni di cellule in una varietà di malattie. Qui mostriamo un metodo per collegare un precoce rilevamento della proteina-apoptosi (annessina V) per una risonanza magnetica-rilevabile nanoparticelle di ossido di ferro (SPIO). Questo metodo può essere esteso ad altre proteine di interesse per generare MRI-rilevabili sonde di imaging molecolare.
Abstract
Apoptosi cellulare è una caratteristica importante di molte malattie, e questa morte cellulare programmata in genere si verifica prima di manifestazioni cliniche della malattia sono evidenti. Un mezzo per rilevare l'apoptosi nelle sue prime fasi e reversibili che garantisca loro un pre-clinica 'finestra' nel corso della quale le misure preventive o terapeutiche potrebbero essere prese per proteggere il cuore dai danni permanenti. Vi presentiamo qui un metodo semplice e robusto di coniugare umana annessina V (ANX), che si lega alle cellule in avidamente le prime, le fasi reversibili di apoptosi, superparamagnetiche di ossido di ferro (SPIO) nanoparticelle, che servono come una risonanza magnetica-rilevabile agente di contrasto. Il metodo inizia con un coniugazione ossidazione delle nanoparticelle SPIO, che ossida gruppi carbossilici sul guscio di polisaccaride SPIO. ANX proteina purificata è poi aggiunto nel contesto di una soluzione di tetraborato di sodio per facilitare l'interazione covalente di ANX con SPIO in un buffer riduzione. Una fase di riduzione finale con sodio borohydride viene eseguita per completare la riduzione, e quindi si spegne la reazione. ANX non coniugato viene rimosso dalla miscela per filtrazione microcentrifuga. La dimensione e la purezza del ANX-SPIO prodotto viene verificata mediante dynamic light scattering (DLS). Questo metodo non richiede aggiunta a, o modifica, il polisaccaride SPIO guscio, al contrario di reticolati metodi particelle di ossido di ferro coniugazione o biotina-etichettati nanoparticelle. Come risultato, questo metodo rappresenta un approccio semplice, robusta che può essere estesa a coniugazione di altre proteine di interesse.
Protocol
Adattato da progetto preliminare 1.
1. Coniugazione di annessina V SPIO
- Ossidare le particelle SPIO (Ocean Nanotech Inc., 5 mg / ml) per 1 ora a 20 ° C al buio in una soluzione con 0,15 M di sodio periodato (Naio 4) (04:01 peso: rapporto in peso) 2.
- Incubare la SPIO ossidato per 12 ore con una proteina purificata ANX (rapporto 1:1, peso: peso) 0,15 M borato di sodio (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) a 20 ° C.
- Ridurre la miscela per 1 ulteriore ora con boroidruro di sodio (NaBH 4) sotto la cappa aspirante e poi bloccato con 0,15 M Tris-HCl.
- Separare il ANX libero da ANX-SPIO mediante centrifugazione a 14000 g (75 micron pori Microcon filtro Millipore, Billerica, MA).
- Raffinare ulteriormente il composto rimuovendo le impurità non associati utilizzando un dispositivo magnetico di separazione (Ocean Nanotech, Inc.).
- Quantificare il filtro retentato (ANX-SPIO) livelli di proteinamediante saggio Bradford proteine e conservare a -80 ° C a 2 mg / ml in 0,1 M Tris-HCl con 1% di albumina e di inibitori della proteasi (proteasi Halt, Thermo Scientific, 1-50 mg / mg ANX).
2. Light Scattering dinamico
- Separatamente diluire il SPIO e ANX-SPIO in PBS ad una densità ottica di 0,1 e analizzare mediante diffusione di luce dinamica in una macchina Zetasizer Nano DLS (Malvern Inc., Worcestershire, UK) 3.
- Ottenere picchi monomodale (idealmente) per il composto, con Z dimensione particellare in media e indice di polidispersità (PDI). Confrontare questa dimensione al DLS-misurato dimensioni delle nanoparticelle ossido di ferro da solo. ANX-SPIO DLS risultati hanno mostrato un coniugato idrodinamico diametro delle particelle di 78 nm con un PDI di 0,13 1, riflettendo una omogenea ANX-SPIO specie 3.
3. Coltura cellulare, induzione di apoptosi in cultura, e la RM di cellule in coltura
- La cultura degli adulti mesenchimali del midollo osseo di topo scelle TEM (mMSCs) in DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina (Invitrogen, Inc.), preferibilmente al passaggio 20-30 Aprile.
- Indurre l'apoptosi nelle cellule di coltura mediante trattamento per periodi variabili a 37 ° C con DOX (Sigma, 1 mM in 0,9% soluzione salina, una concentrazione di 1 pM in media) 12.
- Quantificare la quantità di apoptosi nella cultura utilizzando MRI con ANX-SPIO (descritto in 3.4) o usando la microscopia dopo TUNEL macchia (APO-BrdUTM TUNEL Assay Kit, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) o dopo la macchia con ANX-FITC (Roche, Svizzera).
- Etichettare le cellule con ANX-SPIO (10 mg di proteina / ml mezzo eccezione di quanto indicato), oppure con un peso equivalente di libera SPIO (5 mg), per 15 min a 37 ° C. Lavare 4 volte con PBS, e sovrapposizione con 1 ml di 1% agarosio per impedire la diffusione delle nanoparticelle SPIO. Eseguire MRI dei piatti (descritto sotto). In alternativa, lavare le cellule e Tripsinizzare dopo DOX e ANX-SPIO etichettatura, quindi consentire alle cellule diformare pellet in provette Eppendorf.
4. In Vitro MRI
- Usare un 1.5 o 3 Tesla GE scanner Signa EXCITE con batteria standard del ricevitore al ginocchio per l'analisi in vitro MRI.
- Porre le capsule di coltura o provette in un fantasma agar e immagini usando un gradiente-echo sequenza viziato gradiente: tempo di ripetizione (TR) 550 ms, tempo di eco (TE) 10 ms, flip angle 15 °, matrice 256 x 256, campo di vista di 3 cm x 3 cm, spessore 1,3 mm, il numero delle medie (NEX) 2, distanza 0 mm 5. Immagine assialmente attraverso lo strato di cellule sulla piastra di T2 * perdita di segnale, utilizzando le regioni d'interesse (ROI) di una zona fissa (per esempio, 0,8 mm 2). Regolare per lo sfondo utilizzando il controllo del segnale ROI dal fantasma agar. Misurare il rumore di fondo dal segnale dell'aria circostante il fantasma.
- Calcolare il contrasto MRI-to-Noise Ratio (CNR: [SI campione ROI-SI di controllo ROI] / [SD del SI del rumore di fondo], dove SI è l'intensità del segnale eSD è la deviazione standard) è stato calcolato per ciascun piatto di coltura.
5. Risultati rappresentativi
Misura del T2 * perdita di segnale in vitro richiede un fantoccio omogeneo agar e la mancanza di bolle d'aria, che creerà nulla artefatto segnale. Questo artefatto è difficile da distinguere da vera e propria perdita di segnale T2 * di SPIO, ed è fondamentale per i risultati interpretabili. Si veda la Figura 1 per un esempio di un manufatto aria così come ossido di ferro effettivo T2 * perdita di segnale.
Per nell'imaging piatto di coltura in vitro, applicare un volume adeguato di gel di agar per ciascun piatto di coltura, in modo che sufficienti sezioni assiali MRI, che sono circa 1 mm di spessore, possono essere adeguatamente immagine l'intera piastra. Figura 2 illustra il segnale previsto MRI da piastre di coltura individuali in agar. Vi è tipicamente una certa variazione del segnale ai bordi della piastra, così analisi delle regioni di intcresta dovrebbero evitare queste aree irregolari.
Figura 1. ANX-SPIO rileva l'apoptosi in colture di cardiomiociti neonatali di ratto. Figura 1A mostra una foto di pellet cardiomiociti neonatali trattati con soluzione di controllo (tubo a sinistra), ANX-SPIO (tubo al centro) e DOX + ANX-SPIO (tubo a destra) . Notare il colore brunastro della DOX + ANX-SPIO cellule trattate, riflettendo un aumento della ritenzione ANX-SPIO composto in cellule apoptotiche. Figura 1B in vitro immagini MRI mostrano l'intensa perdita del segnale T2 * dei + DOX ANX-SPIO cellule. Inoltre, una bolla d'aria è visibile tra il 4 ° e 5 ° tubi Eppendorf (piccolo vuoto segnale nero), che è simile al segnale di vuoto ANX-SPIO, e che può influire analisi del CNR.
Figura 2. ANX-SPIOlegame è specifico per le cellule apoptotiche in coltura. Figura 2A mostra cardiomiociti di ratto apoptotici neonatali sui piatti cultura, sottoposti a uno ANX-FLUOS colorazione o ANX-SPIO colorazione, con concentrazioni basse e alte (sinistra e destra, rispettivamente) di ANX-SPIO. Si noti la diversa T2 * perdita di segnale (segnale nero) di cellule apoptotiche che sono stati trattati con fluorescente ANX (ANX-FLUOS) e bassi livelli rispetto ai livelli elevati di ANX-SPIO. L'aumento della perdita di segnale T2 * a destra è associata ad una marcata riduzione ANX-FLUOS segnale, che è stato gareggiato fuori dai maggiori ASX-SPIO concentrazioni. Figura 2B illustra il legame competitivo di ANX-SPIO rispetto ANX-FLUOS segnale e la dissociazione costante, K i. L'asse X indica la concentrazione di proteine Annexin in scala logaritmica.
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Discussion
Il metodo descritto per il collegamento coniugazione SPIO per annessina V sfrutta i gruppi amminici della catena laterale di annessina e le frazioni carbossilici della nanoparticelle SPIO. Attraverso specifici ossidoriduzione passaggi, legame covalente di questi composti può essere raggiunto, e il risultante nanoparticella funzionalizzato può essere isolato. Questo metodo può essere generalizzato ad altre proteine e nanoparticelle di interesse.
Le fasi più critiche sono le condizioni di ossidazione e riduzione, effettuate le temperature adeguate e con miscelazione gentile. Bassa resa può risultare da un'ossidazione incompleta o riduzione, che si traduce in libero residuo annessina V che viene rimosso durante la fase di filtrazione. Quando viene applicato ad altre proteine di interesse, condizioni ottimali possono variare da quelli sopra descritti. Tuttavia, una volta che tali condizioni ottimali sono definite, la proteina filtrato libero può diminuire di una quantità trascurabile, e quindi, filtrazione m microcentrifugaay divenuto superfluo. Infatti, filtrazione in eccesso può ridurre la resa finale composto dovuta al legame non specifico al filtro stesso. In questo caso, pre-filtraggio 1% albumina attraverso il filtro riduce legame non specifico del composto coniugato al filtro e migliorare la resa. DLS analisi del composto finale, e così come misure di concentrazione di proteine del filtrato, aiuterà a determinare se residua proteina libera è presente.
La presenza di SPIO libero nel composto finale è anche un potenziale contaminante. A tal fine, DLS è stato impiegato per verificare la purezza. Un picco da monomodale DLS contribuisce ad assicurare una singolare specie di ossido di ferro. Gratis SPIO produce da solo un picco distinto DLS a 46nm e non era presente in ANX-SPIO preparativi.
Diverse opzioni per bioconiugazione sono disponibili 6-12 che impiegano i meccanismi alternativi coniugando, quali l'interazione biotina-streptavidina o proteina reticolazione di personalizzazione nanoparticles. Il metodo qui presentato rappresenta un robusto, approccio ampiamente applicabile per la coniugazione di nanoparticelle magnetiche per proteine di interesse, senza l'uso di nanoparticelle specializzati.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
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