Summary
A detecção precoce de apoptose pode identificar populações de risco de células em uma variedade de doenças. Aqui demonstramos um método para ligar uma proteína de apoptose de detecção precoce (anexina V) a uma nanopartícula de óxido de MRI-detectável de ferro (SPIO). Este método pode ser estendido para outras proteínas de interesse para gerar sondas de ressonância magnética-detectáveis de imagens moleculares.
Abstract
Apoptose celular é uma característica proeminente de muitas doenças, e esta morte celular programada normalmente ocorre antes de manifestações clínicas da doença são evidentes. Um meio para detectar apoptose em suas primeiras etapas reversíveis e iria pagar um pré-clínica "janela" durante o qual as medidas preventivas ou terapêuticas podem ser tomadas para proteger o coração contra danos permanentes. Apresentamos aqui um método simples e robusto para conjugar humano anexina V (ANX), que avidamente se liga às células durante as primeiras, etapas reversíveis de apoptose, a superparamagnéticas óxido de ferro (SPIO) nanopartículas, que servem como um agente de contraste para IRM-detectável. O método de conjugação começa com uma oxidação das nanopartículas SPIO que oxida grupos carboxilo na casca de polissacárido de SPIO. Proteína purificada ANX é então adicionado na configuração de uma solução de borato de sódio para facilitar a interacção covalente de ANX com SPIO num tampão de redução. Um passo de redução final com borohydrid de sódioe é realizada para completar a redução, e, em seguida, a reacção é arrefecida. ANX não conjugada é removido da mistura por filtração microcentrifugadora. O tamanho e pureza do produto ANX-SPIO é verificada por dispersão dinâmica de luz (DLS). Este método não necessita de adição a, ou a modificação de, o polissacárido SPIO concha, em oposição a ligação cruzada de partículas de óxido de ferro métodos de conjugação ou biotina-rotulados nanopartículas. Como resultado, este método representa uma abordagem simples, robusto que pode ser alargado a conjugação de outras proteínas de interesse.
Protocol
Adaptado a partir de estudo prévio 1.
1. Conjugação de anexina V para SPIO
- Oxidar partículas SPIO (oceano Nanotech Inc., 5 mg / mL) durante 1 hora a 20 ° C no escuro em solução com 0,15 M de sódio periodato (NaIO4) (4:1 em peso: proporção em peso) 2.
- Incubar a SPIO oxidado durante 12 horas com purificado ANX proteína (proporção 1:1, peso: peso) em borato de sódio 0,15 M (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) a 20 ° C.
- Reduzir ainda mais a mistura durante 1 hora com boro-hidreto de sódio (NaBH4), sob a hotte e, em seguida, diluiu-se com 0,15 M de Tris-HCl.
- Separa-se a ANX livre de ANX-SPIO por centrifugação a 14.000 xg (75 mM de poro Microcon filtro, Millipore, Billerica, MA).
- Refinar ainda mais o composto através da remoção de impurezas não acoplados usando um dispositivo separador magnético (Oceano Nanotech, Inc.).
- Quantificar o retentado filtro (ANX-SPIO) níveis de proteínapor Bradford ensaio de proteína e armazenar a -80 ° C a 2 mg / mL em 0,1 M Tris-HCl com 1% de soro de albumina e os inibidores de protease (Inibidor de Protease Halt, Thermo Scientific, 1-50 mg / mg ANX).
2. Espalhamento dinâmico de luz
- Separadamente diluir a SPIO e ANX-SPIO em PBS para uma densidade óptica de 0,1 e analisar por dispersão dinâmica de luz em uma máquina de Zetasizer DLS Nano (Malvern Inc., Worcestershire, Reino Unido) 3.
- Obter picos monomodal (idealmente) para o composto, com um tamanho de partícula Z-média e do índice de polidispersão (PDI). Comparar este tamanho ao tamanho DLS-medidos das nanopartículas de óxido de ferro sozinho. Resultados ANX-SPIO DLS mostrou um diâmetro hidrodinâmico conjugado de partículas de 78 nm com um PDI de 0,13 um, reflectindo um homogéneos ANX-SPIO espécies 3.
3. Cultura Celular, indução de apoptose em Cultura, e ressonância magnética das células em cultura
- Cultura adulto rato de medula óssea mesenquimal scélulas TEM (mMSCs) em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Inc.), de preferência a passagem 20-30 abril.
- Induzir a apoptose nas células de cultura por tratamento para diferentes tempos a 37 ° C com DOX (Sigma, 1 mM em solução salina a 0,9%, 1 uM em meio de concentração) 12.
- Quantificar a quantidade de apoptose em cultura utilizando ressonância magnética com ANX-SPIO (descrito em 3.4 abaixo) ou usando microscopia após TUNEL mancha (APO-BrdUTM Assay Kit TUNEL, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) ou após a mancha com ANX-FITC (Roche, Suíça).
- Rotular as células com ANX-SPIO (10 mg médio de proteína / mL, excepto como notado), ou com um peso equivalente de livre SPIO (5 mg), durante 15 min a 37 ° C. Lavar 4 vezes com PBS, e de sobreposição com 1 mL de agarose a 1% para evitar a difusão das nanopartículas SPIO. Realizar MRI dos pratos (descrito abaixo). Alternativamente, lavar as células e depois trypsinize DOX e ANX-SPIO rotulagem, então permitir que as célulasformar pelotas em tubos Eppendorf.
4. In Vitro RM
- Use um de 1,5 ou 3 Tesla GE scanner de EXCITE Signa com bobina padrão joelho receptor in vitro para a análise de ressonância magnética.
- Coloque as placas de cultura ou tubos em um phantom de ágar, e imagens utilizando um gradiente de eco-seqüência gradiente mimada: tempo de repetição (TR) 550 ms, tempo de eco (TE) 10 ms, flip ângulo de 15 °, matriz de 256 x 256, em campo de-vista de 3 cm x 3 cm, espessura de fatia 1,3 mm, número de médias (NEX) 2, mm de espaçamento 0 5. Imagem axialmente através da camada de células na placa para a perda de sinal T2 *, utilizando-se regiões de interesse (ROIs) de uma área fixa (por exemplo, 0,8 mm 2). Ajuste para o fundo usando o controle de sinal de ROI do phantom de ágar. Medir o ruído de fundo a partir do sinal do ar que circunda a tracejado.
- Calcular a relação de contraste-ruído MRI (CNR: [amostra SI-SI controle ROI ROI] / [SD de SI de ruído de fundo], onde SI é a intensidade do sinal eSD é o desvio padrão) foi calculada para cada prato de cultura.
5. Os resultados representativos
Medição da perda de sinal T2 * in vitro requer um fantasma agar homogénea e à falta de bolhas de ar, o que irá criar artefacto vazio sinal. Este artefato é difícil de distinguir de uma verdadeira perda de sinal T2 * de SPIO, e é fundamental para resultados interpretáveis. Favor ver Figura 1 para um exemplo de um artefacto de ar, bem como o óxido de ferro genuína T2 perda de sinal *.
Para in vitro de imagem prato de cultura, aplicar um volume apropriado de gel de agar a cada prato de cultura, de modo que suficientes axiais fatias de ressonância magnética, que são cerca de 1 mm de espessura, podem ser feitas de forma adequada a imagem do prato inteiro. A Figura 2 ilustra o sinal esperado RM a partir de placas de cultura individuais em agar. Há tipicamente alguma variação de sinal nas bordas da placa, de modo a análise das regiões de interest devem evitar essas áreas irregulares.
Figura 1. ANX-SPIO detecta apoptose em cultura de cardiomiócitos de ratos neonatos. Figura 1A mostra uma foto de peletizadas cardiomiócitos neonatais tratados com solução de controle (tubo à esquerda), ANX-SPIO (tubo central), e + DOX ANX-SPIO (tubo à direita) . Observe a cor acastanhada da DOX + ANX-SPIO células tratadas, refletindo maior retenção do composto ANX-SPIO em células apoptóticas. Figura 1B Em imagens de ressonância magnética in vitro mostram a intensa perda de sinal T2 * do + DOX ANX-SPIO células. Além disso, uma bolha de ar é visto entre os dias 4 e 5 th tubos Eppendorf (void pequeno sinal preto), que é semelhante ao vazio sinal de ANX-SPIO, e que podem afectar a análise de CNR.
Figura 2. ANX-SPIOa ligação é específica para células apoptóticas em cultura. Figura 2A demonstra cardiomiócitos de ratos neonatais apoptóticas em pratos de cultura, submetidos a qualquer coloração ANX-FLUOS ou ANX-SPIO coloração, com concentrações baixas e altas (esquerda e direita, respectivamente) de ANX-SPIO. Note-se a diferentes T2 * perda de sinal (sinal preto) de células apoptóticas que foram tratados com ANX fluorescente (ANX-FLUOS) e níveis baixos, versus os níveis elevados de ANX-SPIO. O aumento T2 * perda de sinal no lado direito está associado com uma marcadamente reduzida sinal ANX-FLUOS, que tem sido competiu fora por mais elevados ASX SPIO-concentrações. Figura 2B ilustra a ligação competitiva de ANX-SPIO contra ANX-FLUOS sinal ea dissociação constante, K i. O eixo dos X indica a concentração de proteína anexina em escala logarítmica.
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Discussion
O método de conjugação descrito para a ligação de SPIO a anexina V explora os grupos de cadeia lateral de amina de anexina e as porções carboxilo da nanopartícula SPIO. Através específicos de oxidação-redução passos, ligação covalente destes compostos pode ser alcançado, e as nanopartículas resultante funcionalizado pode ser isolado. Este método pode ser generalizado a outras proteínas e nanopartículas de interesse.
Os passos mais críticos são as condições de oxidação e redução, realizados nas temperaturas adequadas e com agitação suave. Rendimento baixo pode resultar da oxidação incompleta ou redução, o que resulta em residual livre anexina V que é removido durante o passo de filtração. Quando aplicado a outras proteínas de interesse, as condições óptimas podem variar de os descritos acima. No entanto, uma vez que essas condições óptimas são definidos, a proteína filtrada livre pode diminuir para uma quantidade insignificante, e, portanto, m filtração microcentrífugaay se tornam supérfluas. Com efeito, a filtração em excesso pode reduzir o rendimento composto final devido a ligação não específica para o próprio filtro. Se isto ocorrer, a pré-filtragem 1% de albumina através do filtro irá reduzir a ligação não específica do composto conjugado com o filtro e melhorar o rendimento. DLS análise do composto final, e bem como as medições de concentração de proteínas do filtrado, irá ajudar a determinar se a proteína residual livre está presente.
A presença de SPIO livre no composto final é também um contaminante potencial. Para este fim, DLS foi utilizado para verificar a pureza. Um pico monomodal por DLS ajuda a assegurar uma espécie de óxido de ferro singulares. Livre SPIO sozinha produz um pico DLS distinto em 46nm e não estava presente no ANX-SPIO preparativos.
Várias opções para bioconjugação são 6-12 disponível que empregam os mecanismos alternativos conjugando, tais como biotina-estreptavidina interacção ou a proteína de ligação cruzada de Na personalizadanoparticles. O método aqui apresentado representa uma abordagem, robusto amplamente aplicável para a conjugação de nanopartículas magnéticas para proteínas de interesse, sem a utilização de nanopartículas especializados.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
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