Summary
Раннее выявление апоптоза может выявить группы риска клетки в самых разных заболеваний. Здесь мы покажем способ связать ранний апоптоз обнаружения белка (Аннексин V) к МРТ обнаруживаются наночастицы оксида железа (Спио). Этот метод может быть распространен и на другие белки, представляющие интерес для создания МРТ обнаруживаются молекулярных зондов изображения.
Abstract
Сотовые апоптоз является характерной чертой многих заболеваний, и это запрограммированная смерть клетки обычно происходит до клинических проявлений болезни очевидны. Средства для обнаружения апоптоза в его ранних, обратимых стадиях бы позволить себе доклинических «окно» в течение которых профилактических или лечебных мероприятий могут быть приняты для защиты сердца от повреждений. Мы представляем здесь простой и надежный метод сопряженных человека Аннексин V (ANX), которые активно связывается с клетками на ранних, обратимых стадиях апоптоза, в суперпарамагнитных оксида железа (Спио) наночастиц, которые служат МРТ обнаруживаются контрастное вещество. Сопряжение метод начинается с окисления наночастиц Спио, который окисляет карбоксильных групп на полисахарид оболочки Спио. Очищенный белок ANX затем добавляется в условиях решение борат натрия для облегчения ковалентного взаимодействия с ANX Спио в восстановительной буфера. Заключительного этапа сокращения натрия borohydridэлектронной осуществляется завершить сокращение, а затем реакция угасает. Неконъюгированного ANX удаляется из микс микроцентрифужных фильтрации. Размер и чистота ANX-Спио продукт проверяется динамического рассеяния света (DLS). Этот метод не требует дополнение или изменение, полисахарид Спио оболочки, в отличие от сшитых частиц оксида железа, методы сопряжения или биотин-меченых наночастиц. В результате, этот метод представляет собой простой, надежный подход, который может быть продлен до сопряжения других белков, представляющих интерес.
Protocol
По материалам предварительного исследования 1.
1. Сопряжение Аннексин V в Спио
- Окислять Спио частиц (Ocean Nanotech Inc, 5 мг / мл) в течение 1 часа при 20 ° С в темное время суток в растворе 0,15 М натрий периодатом (NAIO 4) (4:01 вес: весу) 2.
- Инкубируйте окисленных Спио в течение 12 часов с очищенной ANX белком (1:1, вес: вес) в 0,15 М борат натрия (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) при 20 ° C.
- Уменьшить смесь далее в течение 1 часа боргидридом натрия (NaBH 4) под вытяжкой, а затем тушить с 0,15 М Трис-HCl.
- Отделите от свободных ANX ANX-Спио центрифугированием при 14000 мкг (75 мкм пор микроконтроллер фильтр Millipore, Billerica, MA).
- Дальнейшие уточнения соединения путем удаления несвязанного примесей с помощью магнитного сепаратора устройства (Ocean Nanotech, Inc.)
- Количественная фильтр ретентат (ANX-Спио) белкапо Бредфорда белка и хранят при -80 ° C в дозе 2 мг / мл в 0,1 М Трис-HCl 1% сывороточного альбумина и ингибиторы протеазы (Halt ингибитор протеазы, Thermo Scientific, 1-50 мг / мг ANX).
2. Динамического рассеяния света
- Отдельно разбавить Спио и ANX-Спио в PBS с оптической плотностью 0,1 и анализа динамического рассеяния света в Zetasizer Nano DLS машины (Malvern Inc, Вустершир, Великобритания) 3.
- Получить мономодальных пики (в идеале) для соединения с Z-средний размер частиц и полидисперсности (PDI). Сравните размер DLS-измерений размеров наночастиц оксида железа в одиночку. ANX-Спио DLS Результаты показали, сопряженных гидродинамических диаметр частиц 78 нм с PDI 0.13 1, отражающих однородные ANX-Спио видов 3.
3. Культуры клеток, индукции апоптоза в культуре, и МРТ культивируемых клеток
- Культура взрослой мыши костного мозга мезенхимальные стемпература клеток (mMSCs) в DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицин (Invitrogen, Inc), предпочтительно при прохождении 20-30 4.
- Индуцировать апоптоз в культуре клеток для лечения различных раза при 37 ° C с DOX (Sigma, 1 мм в 0,9% раствор, 1 мкМ концентрации в средствах массовой информации) 12.
- Определить количество апоптоза в культуре, используя либо МРТ с ANX-Спио (описано в 3.4 ниже) или с помощью микроскопии после окраски TUNEL (APO-BrdUTM TUNEL Анализ Kit, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) или после пятно ANX-FITC (Roche, Швейцария).
- Назовите клетки с ANX-Спио (10 мг белка / мл среды, кроме как уже отмечалось), или эквивалентную массу свободного Спио (5 мг) в течение 15 мин при 37 ° C. Промыть 4 раза PBS, и наложения с 1 мл 1% агарозном для предотвращения распространения наночастиц Спио. Выполните МРТ блюда (см. ниже). Кроме того, мыть клетки и trypsinize после DOX и ANX-Спио маркировки, то позволяют клеткамформирование гранул в Эппендорф труб.
4. In Vitro МРТ
- Используйте 1,5 или 3 Тесла GE Signa EXCITE сканер со стандартной катушки приемника колено для анализа лабораторных МРТ.
- Место культуры блюда или трубы в агар призрак, и образ, используя градиент-эхо последовательность испорченный градиент: Время повторения (TR) 550 мс Время эхо (TE) 10 мс, флип угол 15 °, матрица 256 х 256, полевых из вида 3 см х 3 см, толщина среза 1,3 мм, количество средних (НИС) 2, расстояние 0 мм 5. Изображение аксиально через слой клеток на пластине для T2 * потери сигнала, используя регионах интересов, (трансформирования) фиксированной области (например, 0,8 мм 2). Установите для фона, используя контроль ROI сигнал от агара призрак. Измерение шума от сигнала окружающего воздуха призрак.
- Рассчитать МРТ контраст к шум (CNR: [SI образец ROI-SI управление ROI] / [SD СИ фонового шума], где СИ интенсивность сигнала, аSD-стандартное отклонение) была рассчитана для каждой культуры блюдо.
5. Представитель Результаты
Измерение T2 * потери сигнала в пробирке требуются однородную призрак агар и отсутствие пузырьков воздуха, которые будут создавать артефакты сигнала недействительными. Этот артефакт трудно отличить от подлинных T2 * сигнал потери Спио и имеет решающее значение для интерпретации результатов. Пожалуйста, см. рисунок 1 для примера воздух артефакт, а также подлинные оксида железа T2 * потери сигнала.
Для изображений в пробирке блюдо культуры, применять соответствующий объем агар гель для каждой культуры блюдо, так что достаточной осевой МРТ ломтиками, которые примерно на 1 мм, может быть адекватно изображение всего блюда. На рисунке 2 показан ожидаемый сигнал МРТ из отдельных пластин культуры в агар. Существует правило, некоторые изменения сигнала на краях пластины, поэтому анализ регионов Interest должны избегать этих неровностей.
Рисунок 1. ANX-Спио обнаруживает апоптоза в культуре неонатальных кардиомиоцитов крысы. Рисунок 1А показывает фотографию гранулированный новорожденных кардиомиоцитов относиться с контрольным раствором (левая труба), ANX-Спио (средняя трубка), а DOX + ANX-Спио (правая труба) . Обратите внимание на коричневатый цвет DOX + ANX-Спио обработанных клеток, отражающих увеличился сохранение ANX-Спио соединения в апоптоз клеток. Рисунок 1B В пробирке изображений МРТ показывает интенсивный T2 * потери сигнала в DOX + ANX-Спио клеток. Кроме того, воздушные пузыри видно между 4-й и 5-й Эппендорф труб (маленькая черная пустота сигнала), который похож на сигнал пустоту ANX-Спио, и которые могут повлиять на анализ CNR.
Рисунок 2. ANX-Спиообязательным является специфическим для апоптоза клеток в культуре. Рисунок 2А показывает апоптоза кардиомиоцитов новорожденных крыс по культуре блюда, подвергаются либо ANX-FLUOS окрашивания или ANX-Спио окрашивания, с низкими и высокими концентрациями (слева и справа, соответственно) ANX-Спио. Обратите внимание на различные T2 * потери сигнала (черно-сигнал) апоптотических клеток, которые лечились с люминесцентными ANX (ANX-FLUOS) и низкий уровень по сравнению с высоким уровнем ANX-Спио. Увеличение T2 * потери сигнала на право связано с заметно снижается ANX-FLUOS сигнал, который конкурировал с более высокими ASX-Спио концентрации. Рисунок 2B иллюстрирует конкурентного связывания ANX-Спио против ANX-FLUOS сигнала и диссоциации постоянная, К я. X-ось обозначает Аннексин концентрации белка в логарифмической шкале.
Фильм 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительныхфильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный метод сопряжения для связи Спио в Аннексин V использует боковой цепи аминогруппами Аннексин и карбоксильной фрагменты из наночастиц Спио. Через определенный окислительно-восстановительные шаги, ковалентная связь этих соединений может быть достигнуто, и в результате функционализированных наночастиц могут быть изолированы. Этот метод может быть обобщен на другие белки и наночастиц интерес.
Наиболее важные шаги окисления и восстановления условий, осуществляется в соответствующих температурах и нежный смешивания. Низкая доходность может быть результатом неполного окисления или восстановления, в результате чего остаточная бесплатно Аннексин V, который удаляется при фильтрации шаг. Применительно к другим белкам интересов, оптимальные условия могут отличаться от описанных выше. Однако, как только те оптимальные условия определены, фильтруется свободного белка может уменьшить на незначительную величину и, следовательно, м микроцентрифужных фильтрацииай становятся излишними. Действительно, избыток фильтрации может снизить конечный выход соединения из-за неспецифического связывания с самого фильтра. Если это произойдет, предварительной фильтрации 1% альбумина через фильтр уменьшения неспецифического связывания сопряженной соединение с фильтром и повышения урожайности. DLS анализа конечного соединения, а также концентрация белка измерения фильтрат, поможет определить, есть ли свободный остаточный белок присутствует.
Наличие свободного Спио в финале соединения также является потенциальным загрязнителем. С этой целью DLS была использована для проверки чистоты. Мономодальных пика DLS помогает обеспечить особый вид оксида железа. Бесплатный Спио только производит отчетливый пик DLS на 46nm и не было в ANX-Спио препаратов.
Несколько вариантов bioconjugation доступны 6-12, которые используют альтернативные сопряжения механизмы, такие как биотин-стрептавидин взаимодействия белков или сшивания настроены паnoparticles. Метод, представленные здесь, представляет собой надежный, широко применяемый подход для сопряжения магнитных наночастиц с белками интереса, без использования специальных наночастиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Национальные институты здравоохранения, NHLBI (RD, PY, PS).
Американская Ассоциация Сердца (JL).
Стэнфордский университет, VPUE Грант (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
