Summary
Apoptoz Erken teşhis hastalıklarının çeşitli risk altındaki hücre popülasyonu tespit edebilir. Burada bir MR-saptanabilir demir oksit nanoparçacık (SPIO) bir erken apoptozis algılama protein (Annexin V) bağlamak için bir yöntem gösterilmektedir. Bu yöntem MR-saptanabilir moleküler görüntüleme probları üretmek için ilgi diğer proteinlere uzatılabilir.
Abstract
Hücresel apoptoz birçok hastalığın önemli bir özelliktir ve hastalığın klinik belirtileri ortaya çıkmadan bu programlanmış hücre ölümü genellikle oluşur. Onun erken, tersinir aşamalarında apoptoz algılamak için bir araç önleyici veya tedavi edici önlemler kalıcı hasarlardan kalbi korumak için alınabilecek sırasında bir klinik öncesi 'pencere' göze olacaktır. Biz burada MR-saptanabilir kontrast ajan olarak hizmet süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nanopartiküller için heyecanla apoptoz erken, tersinir aşamalarında hücrelerine bağlanarak insan Annexin V (ANX), birleşmek için basit ve sağlam bir yöntem sunmaktadır. Konjugasyon yöntemi SPIO ve polisakkarit kabuk karboksil grupları okside SPIO nanopartiküller, bir oksidasyon ile başlar. ANX proteini saflaştırılmış ve sonra bir indirgeyici tampon içinde SPIO ile ANX arasında kovalent etkileşimi kolaylaştırmak için bir sodyum borat çözeltisi ortamda eklenir. Sodyum borohydrid ile son bir azalma adıme redüksiyon tamamlamak üzere gerçekleştirilir ve daha sonra reaksiyon söndürüldü. Konjuge olmayan ANX mikrosantrifüj filtrasyon ile karışım kaldırılır. ANX-SPIO ürünün saflığı boyutu ve dinamik ışık saçılması (DLS) ile teyit edilmektedir. Bu yöntem ek olarak, veya modifikasyonu gerektirmez, çapraz bağlı olarak demir oksit partikül konjugasyon yöntemler veya biyotin etiketli nanopartiküller karşıt polisakkarid SPIO kabuk. Sonuç olarak, bu yöntem, ilgi diğer proteinler konjugasyon uzayabilir basit, güçlü bir yaklaşımı temsil eder.
Protocol
Önceki çalışmada 1 den uyarlanmıştır.
1. SPIO için Annexin V Konjugasyon
- 2: 0.15 M sodyum periodat (NaIO 4) (ağırlık oranı 04:01 ağırlıkça) ile çözelti içinde karanlıkta 20, 1 saat boyunca SPIO partikülleri (Ocean Nanotech Inc, 5 mg / mL) ° C okside.
- 20 ° C'de 0.15 M sodyum borat (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O): ANX protein (ağırlık 1:1 oranı, ağırlık) saflaştırılmış ile 12 saat boyunca okside SPIO inkübe
- Çeker ocak altında sodyum borohidrid (NaBH4) ile 1 saat boyunca daha da azaltmak ve karışım daha sonra 0.15 M Tris-HCl sertleştirme.
- 14.000 xg (75 mikron gözenek Microcon filtresi, Millipore, Billerica, MA) santrifüj ile ANX-SPIO gelen ücretsiz ANX ayırın.
- Daha bir Magnetik Separatör cihazı (Ocean Nanotech, Inc) kullanarak ilişkisiz kirleri kaldırarak bileşik geliştirebilirsiniz.
- Filtre retentat (ANX-SPIO) protein düzeyleri ölçmek-80 azından Bradford protein metodu ve deposu tarafından ° C'de 2 azından% 1 serum albumin ve proteaz inhibitörü (Halt proteaz inhibitör, Termo Scientific, 1-50 mg / mg ANX) ile 0.1 M Tris-HCl içinde mg / ml.
2. Dinamik ışık saçılımı
- Ayrı 0.1 optik yoğunluğu PBS SPIO ve ANX-SPIO sulandırmak ve Zetasizer Nano DLS makinesi (Malvern Inc, Worcestershire, Birleşik Krallık) 3 dinamik ışık saçılımı analiz yaparlar.
- Z-ortalama parçacık boyutu ve polidispersite indeksi (PDI) ile birlikte, bileşik için monomodal zirveleri (ideal) elde edilir. Tek başına demir oksit Nanopartikülün DLS-ölçülen boyutu bu boyutu karşılaştırın. ANX-SPIO DLS sonuçları homojen bir ANX-SPIO türler 3 yansıtan 0.13 1 bir PDI ile 78 nm konjuge parçacık hidrodinamik çapı gösterdi.
3. Hücre Kültürü, Kültür apoptoz İndüksiyonu ve Doku ve Hücre MRG
- Kültür yetişkin fare kemik iliği mezenkimal sDMEM içinde TEM hücreleri (MMSC)% 10 FBS ve tercihen pasaj az% 1 penisilin streptomisin (Invitrogen, Inc), 20-30 Nisan ile desteklenmiş.
- DOX (Sigma,% 0.9 tuzlu su içinde 1 mM, ortam içinde 1 uM konsantrasyon) 12 ile 37 ° C 'de kat değişen için işleme tabi tutulmasıyla kültürü hücrelerde apoptoza yol.
- ANX-SPIO (aşağıda 3.4 'de açıklanan) ile MR veya TUNEL leke sonra mikroskop kullanılarak (APO-BrdUTM TUNEL Test Kiti, Moleküler Problar / Invitrogen, Eugene, OR) veya ANX-FITC leke sonra birini kullanarak kültürü apoptozisin miktarını ölçmek (Roche, İsviçre).
- 37, 15 dak ° C. için, ANX-SPIO (olarak belirtilmedikçe 10 mg protein / mL, orta), ya da serbest SPIO (5 mg), eşdeğer bir kilo sahip hücrelerin etiketlemek SPIO Nanopartiküllerin difüzyon önlemek için% 1 agaroz 1 mL PBS ile 4 kat ve bindirme yıkayın. Yemekler MRG (aşağıda açıklanmıştır) gerçekleştirin. Alternatif olarak, hücreler yıkayıp DOX ve ANX-SPIO işaretlendikten sonra trypsinize, sonra hücreler izinEppendorf tüplere pelet oluştururlar.
4. Vitro MRG'de
- In vitro MRG analizi için standart diz alıcı bobini ile bir 1.5 veya 3 Tesla GE Signa EXCITE tarayıcı kullanın.
- Tekrarlama Süresi (TR) 550 ms, Echo Saat (TE) 10 ms, flip açısı 15 °, matris 256 x 256, alan: kültür kaplarına veya tüpleri agar fantom içine ve gradient-eko spoiled gradient dizisi kullanarak görüntüyü yerleştirin of-view 3 cm x 3 cm, kesit kalınlığı 1,3 mm, ortalama sayısı (NEX) 2, aralık 0 5 mm. Görüntü eksenel sabit bir alanı bölgeleri-of-faiz kullanılarak T2 sinyal kaybı, (ROI) (örneğin, 0,8 mm 2) plaka üzerinde hücre katmanı. Agar hayalet gelen kontrol ROI sinyal kullanılarak arka plan için ayarlayın. Fantom çevreleyen havanın sinyal arka plan gürültü ölçün.
- [SI örnek ROI-SI kontrolü ROI] / SI sinyal yoğunluğunu, [arka plan gürültü SI SD] ve: MR Kontrast-Gürültü Oranı (CNR hesaplayınSD) Standart sapma her kültür kaplarına hesaplandı.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
In vitro T2 * sinyal kaybı ölçüm sinyali geçersiz eser yaratacak homojen bir agar fantom ve hava kabarcıklarının eksikliği gerektirir. Bu eser SPIO hakiki T2 * sinyal kaybı ayırt etmek zordur, ve yorumlanabilir sonuçlar önemlidir. Bir hava eser örnek olarak orijinal demir oksit T2 sinyal kaybı için Şekil 1'de görebilirsiniz.
In vitro kültür kaplarına görüntüleme için kalınlığında yaklaşık 1 mm yeterli aksiyel MR dilimleri, yeterince görüntü tüm çanak yapılabilir, böylece her kültürün çanak agar jel uygun bir hacim uygulanır. Şekil 2 beklenen MRG sinyal göstermektedir agar bireysel kültür plakalardan. Int bölgeleri bazı sinyal plakasının kenar varyasyonu, böylece analizi tipik olarak mevcutturerest bu düzensiz alanlardan kaçınmak gerekir.
Şekil 1. ANX-SPIO doğan sıçanlardan kültüre kardiyomiyositlerde apoptoz algılar. Şekil 1A kontrol solüsyonu (sol tüp), ANX-SPIO (orta boru), DOX + ANX-SPIO (sağ tüp) ile tedavi edilen pelet yenidoğan kardiyomiyositlerin bir fotoğraf gösteriyor . DOX ve kahverengimsi renk + ANX-SPIO tedavi hücreleri, apoptotik hücrelerde ANX-SPIO bileşiğin artan saklama yansıtan unutmayın. In vitro MR görüntüleri Şekil 1B DOX + ANX-SPIO hücrelerin yoğun T2 sinyal kaybı göstermektedir. Ayrıca, bir hava kabarcığı 4. ve sinyal ANX-SPIO yoksun, ve CNR analizi etkileyebilir benzer 5. Eppendorf tüpleri (küçük siyah sinyal void) arasında görülür.
Şekil 2. ANX-SPIObağlama kültürü apoptotik hücreler için spesifik değildir. Şekil 2A ANX-SPIO düşük ve yüksek konsantrasyonlarda (sağ, sol ve sırasıyla) ile ANX-FLUOS boyama veya ANX-SPIO boyama ya maruz kültür kaplarına üzerine apoptotik sıçan neonatal kardiyomiyositler, göstermektedir. Not Farklı T2 floresan ANX (ANX-FLUOS) ve ANX-SPIO yüksek seviyede ve düşük düzeyde tedavi edildi apoptotik hücre * sinyal kaybı (siyah sinyali). Artan T2 sağ * sinyal kaybı daha yüksek ASX-SPIO konsantrasyonları tarafından kapalı yarıştı edilmiş bir belirgin bir azalma oldu ANX-FLUOS sinyali ile ilişkilidir. Şekil 2B ANX-SPIO karşı ANX-FLUOS sinyal ve ayrışma rekabet bağlayıcı göstermektedir sabiti, i K. X-ekseni log ölçeğinde Annexin protein konsantrasyonunu ifade eder.
Film 1. ek görmek için buraya tıklayınfilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Annexin V SPIO bağlama için tarif konjugasyon yöntemi Annexin yan zincirli amin gruplarının ve SPIO Nanopartikülün karboksil yarımlar yararlanır. Belirli bir oksitleme-indirgeme adımlarında, bu bileşiklerin kovalan bağlantı elde edilebilir, ve elde edilen fonksiyonlandırılmış nanoparçacık izole edilebilir. Bu yöntem, diğer proteinler ve ilgi nanopartiküller üzere genelleştirilmiş olabilir.
En önemli aşamaları uygun sıcaklıklarda ve yumuşak karışımı ile gerçekleştirilen oksidasyon ve indirgeme koşulları, bulunmaktadır. Düşük verim eksik oksidasyon veya filtrasyon adım sırasında çıkarılırsa kalan serbest Annexin V ile sonuçlanan azalma ile sonuçlanabilir. Ilgi diğer proteinler uygulandığı zaman, uygun koşulları yukarıda tarif edilenler arasında değişebilir. Bununla birlikte, bir kez de uygun koşullar tanımlandığı gibidir, filtrelenmiş serbest proteini ihmal edilebilir bir miktara azaltılması, ve bu nedenle, mikrosantrifüj filtrasyon m edebiliray gereksiz hale gelir. Gerçekten de, aşırı filtrasyon kendisini filtreye spesifik olmayan bağlama nedeniyle nihai bileşik, verim azaltabilir. Bu durumda, ön-filtreleme filtre aracılığıyla albümini% 1 filtreye konjuge bileşiğin spesifik olmayan bağlama azaltmak ve verimi artıracaktır. Nihai bileşik analizi DLS, ve iyi süzüntü protein konsantrasyonu ölçümleri olarak, kalıntı serbest protein olup olmadığını belirlemek yardımcı olacaktır.
Nihai bileşik, serbest SPIO varlığında de potansiyel bir kirletici madde olup. Bu amaçla, DLS saflığı kontrol etmek için kullanılmıştır. DLS A monomodal pik tekil bir demir oksit türleri sağlamaya yardımcı olur. Bedava SPIO yalnız 46nm de ayrı bir DLS pik üretir ve ANX-SPIO hazırlamalarındaki değildi.
Bioconjugation için çeşitli seçenekler özelleştirilmiş na çapraz bağlama gibi biotin-streptavidin etkileşim veya protein gibi alternatif conjugating mekanizmaları, istihdam kullanılabilir 6-12 vardırnoparticles. Burada sunulan yöntemi uzman nanopartiküllerin kullanmadan, faiz proteinlere manyetik nano parçacıklar konjugasyon için sağlam, yaygın olarak uygulanabilir bir yaklaşımı temsil ediyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Sağlık, NHLBI National Institutes (RD, PY, PS).
Amerikan Kalp Derneği (JL).
Stanford Üniversitesi, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
