Summary
细胞凋亡的早期检测可以识别处于危险的细胞群，在多种疾病。在这里，我们展示了一个方法来链接早期凋亡检测蛋白Annexin V的一个MRI检测的氧化铁纳米粒子（超顺磁性氧化铁）。此方法可扩展到其他感兴趣的蛋白质生成MRI检测的分子成像探针。
Abstract
细胞凋亡是许多疾病的显着特征，这一程序性细胞死亡之前，通常会发生疾病的临床表现是显而易见的。在其最早的，可逆的阶段检测细胞凋亡的一种手段，将承担临床前的'窗口'，预防或治疗措施，在此期间，可以采取保护心脏的永久性损伤。这里我们提出一个简单和可靠的方法，共轭人Annexin V的（ANX），如饥似渴地结合到细胞中最早的，可逆的凋亡阶段，超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米粒子，作为检测的MRI造影剂。共轭方法开始的超顺磁性氧化铁纳米粒子，氧化成羧基的超顺磁性氧化铁多糖壳的氧化。纯化蛋白ANX，然后添加一个硼酸钠溶液，以方便与超顺磁性氧化铁在ANX共价相互作用，减少缓冲区的设置。一个与钠borohydrid最后削减步骤e是执行完成减少，然后淬火反应。未结合ANX从离心过滤组合。动态光散射（DLS）的大小和ANX-超顺磁性氧化铁产品纯度验证。这种方法并不需要，或修改，超顺磁性氧化铁壳多糖，反对交联氧化铁粒子共轭方法或生物素标记的纳米粒子。因此，这种方法代表了一个简单，可靠的方法，可以延长至共轭利益的其他蛋白质。
Protocol
改编自以前的研究1。
1。 Annexin V的共轭超顺磁性氧化铁
- 氧化0.15 M高碘酸钠（NAIO 4）（4:1重量：重量比）为1小时在黑暗中的解决方案与超顺磁性氧化铁粒子（纳米技术公司，海洋5毫克/毫升）在20°C 2。
- 在20°C孵育氧化12小时的超顺磁性氧化铁，用纯化的的ANX蛋白（比例为1:1，重量：重量）0.15 M四硼酸钠（钠2 B 4 O 7 10H 2）
- 进一步减少为1小时与通风柜下硼氢化钠（硼氢化钠4）混合，然后以0.15 M的Tris-HCl解渴。
- ANX-超顺磁性氧化铁在14000 XG（75微米孔隙单片机过滤器，微孔，比尔里卡，MA）的离心分离免费ANX。
- 进一步完善绑定杂质去除，用磁选设备（海洋，纳米技术公司）的化合物。
- 量化过滤器截留（ANX，超顺磁性氧化铁）蛋白水平Bradford蛋白检测，并存储在-80℃时，2毫克/毫升在0.1 M的Tris-HCl，1％的血清白蛋白和蛋白酶抑制剂（HALT蛋白酶抑制剂，Thermo Scientific的1-50毫克/毫克ANX）。
2。动态光散射
- 分别稀释在PBS的超顺磁性氧化铁和超顺磁性氧化铁ANX-0.1的光学密度和动态光散射分析1纳米激光粒度仪当值律师服务机（马尔文公司，伍斯特郡，英国）3。
- 获得该化合物为单峰峰值（理想），一个Z-平均粒径和多分散指数（PDI）。与此相比，单独的氧化铁纳米粒子的DLS-测量大小的大小。 ANX-超顺磁性氧化铁DLS结果表明：共轭粒子流体力学直径的78纳米与0.13 1交车，反映了一个同质ANX-超顺磁性氧化铁物种。
3。细胞文化，文化中的细胞凋亡的诱导，培养细胞的MRI
- 文化成年鼠骨髓间充质小号TEM细胞在培养液（mMSCs的），辅以10％胎牛血清和1％青霉素，链霉素（Invitrogen公司，公司），最好是在流逝，20-30 4。
- 在培养细胞凋亡的诱导治疗不同在37°C，与阿霉素（Sigma公司，1毫米，0.9％的生理盐水，1μM的浓度在媒体）12倍。
- 在培养细胞凋亡的量化使用或者核磁共振与ANX超顺磁性氧化铁（在3.4以下）或使用后，TUNEL染色显微镜（APO-BrdUTM TUNEL法检测试剂盒，分子探针/ Invitrogen公司，尤金，或）或ANX-FITC染色后的金额（瑞士罗氏公司）。
- ANX-超顺磁性氧化铁（蛋白质10毫克/毫升培养基，除非另有说明），或与同等重量的自由，超顺磁性氧化铁（5毫克）标记的细胞，15分钟，在37°C 1毫升1％琼脂糖，以防止扩散的超顺磁性氧化铁纳米粒子清洗4次，用PBS和覆盖。执行的菜肴MRI（如下所述）。另外，洗细胞和trypsinize后，阿霉素和ANX-超顺磁性氧化铁标记，然后让这些细胞Eppendorf管形成颗粒。
4， 体外 MRI
- 使用标准的膝盖， 在体外 MRI分析接收线圈1.5或3特斯拉GE公司Signa的EXCITE扫描器。
- 将培养皿中，成琼脂幻象或管和图像使用梯度回波被宠坏的梯度序列：重复时间（TR），回波时间（TE）550毫秒，10毫秒，翻转角15°，矩阵256×256，现场的视图3厘米×3厘米，层厚1.3毫米，平均人数（国家执行）2，间距0毫米5。图片轴向通过与T2 *信号损失地区的利益，一个固定的区域（投资回报）（例如，0.8平方毫米 ）的盘上的细胞层。使用从琼脂幻象控制投资回报率信号调整的背景。测量背景噪声信号从假体周围的空气。
- 计算的MRI对比噪声比（晨晨：] / [Si样品的投资回报率SI控制的投资回报率，其中SI是信号强度，SI的背景噪音的SD]SD是标准差），计算每个培养皿。
5。代表结果
在体外的T2 *信号损失的测量要求均匀琼脂幻影和缺乏气泡，这将创造信号无效神器的。这件神器是难以区分真正T2的信号损失超顺磁性氧化铁，可解释的结果是至关重要的。空气神器的例子，以及真正的氧化铁与T2 *信号损失，请参阅图1。
在体外培养皿成像，适用于每个培养皿中的琼脂适当的音量，使足够的轴向MRI片，其中约1毫米厚的，可以作出充分的形象整个菜。 图2说明了预期的MRI信号从个人在琼脂培养皿。通常有一些在板的边缘信号的变化，因此INT地区分析erest应该避免这些不平衡的地区。
图1。ANX-超顺磁性氧化铁检测培养的乳鼠心肌细胞凋亡。 图1A显示了颗粒与控制解决方案（左管），ANX，超顺磁性氧化铁（中间管），阿霉素+ ANX-超顺磁性氧化铁（右管）治疗新生儿心肌的照片。注意：棕褐色的阿霉素+ ANX-超顺磁性氧化铁处理的细胞，反映保留在细胞凋亡的ANX超顺磁性氧化铁复合增加。 图1B显示的激烈与T2 *信号损失，阿霉素+ ANX-超顺磁性氧化铁细胞在体外 MRI图像。此外，气泡之间的第 4 次和5 次 Eppendorf管（黑色小信号无效），这是类似的ANX，超顺磁性氧化铁的信号无效，这可能会影响对CNR分析。
图2。ANX-超顺磁性氧化铁约束力是特定文化中的细胞凋亡。 图2A显示凋亡大鼠乳鼠心肌细胞在培养皿中，受到任何ANX FLUOS染色或ANX-超顺磁性氧化铁染色，高，低浓度的ANX，超顺磁性氧化铁（左，右，分别）。请注意不同的T2 *信号损失（黑场信号）荧光ANX（ANX-FLUOS）的水平低与高层次的ANX，超顺磁性氧化铁治疗的细胞凋亡。增加的T2 *信号损失的权利是一个显着减少的ANX-FLUOS信号的，已参加ASX的超顺磁性氧化铁的浓度较高有关。 图2B显示ANX-超顺磁性氧化铁对ANX-FLUOS信号和分离的竞争性结合常数，K I。 X轴表示在日志规模的膜联蛋白的蛋白质浓度。
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Discussion
连接超顺磁性氧化铁Annexin V的共轭方法利用膜联蛋白的侧链胺组和超顺磁性氧化铁纳米粒子的羧基基团。通过特定的氧化还原步骤，这些化合物的共价键可以实现，产生的功能化纳米粒子可以被孤立。此法可推广到其他蛋白质与纳米粒子的利益。
最关键的步骤是氧化还原条件，在适当的温度和温和搅拌。产量低，可能会导致不完全氧化或减少，导致无残留Annexin V的，在过滤步骤去除。当应用到其他感兴趣的蛋白质，最佳条件下可能会有所不同，从上述。然而，一旦这些定义的最佳条件，过滤游离蛋白可能会降低到微不足道，因此，离心过滤米AY成为多余。事实上，多余的过滤可以减少由于非特异性结合滤波器本身的最终化合物产量。如果发生这种情况，前1％白蛋白通过过滤器过滤，将减少非特异性结合的共轭化合物过滤器，并提高产量。 DLS最终化合物的分析，以及滤液蛋白浓度测量，将有助于确定是否存在无残留蛋白。
最终复合超顺磁性氧化铁的存在也是一个潜在的污染物。为此，当值律师服务检查纯度。由当值律师服务的单峰峰值，有助于确保一个单一的氧化铁物种。仅免费超顺磁性氧化铁生产46nm鲜明的DLS和高峰不是在ANX-超顺磁性氧化铁准备。
生物耦合的几个选项是可用6-12雇用替代共轭机制，如生物素-亲和相互作用或蛋白质交联定制NAnoparticles。本文介绍的方法表示利益蛋白的磁性纳米粒子共轭一个强大的，广泛适用的方法，无需使用专门的纳米粒子。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
国家机构的健康，NHLBI（市，PY，PS）。
美国心脏协会（巨浪）。
斯坦福大学，VPUE格兰特（巨浪）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
