Summary
apoptosis의 조기 발견은 질병의 다양한 위험에 처한 세포 인구를 식별할 수 있습니다. 여기 MRI-감지 철 산화물 nanoparticle (SPIO)에 조기 apoptosis 검출 단백질 (Annexin V)를 연결하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 MRI를 - 감지 분자 이미징 프로브를 생성하는 관심의 다른 단백질로 연장될 수있다.
Abstract
세포 apoptosis는 많은 질병들의 두드러진 특징이며, 질병의 임상 발현은 증거들이 이전에 프로그램된 세포 죽음이 발생합니다. 그것의 초기, 가역 단계에서 apoptosis를 감지하는 수단은 예방이나 치료 조치는 영구적인 손상으로부터 심장을 보호하기 위해 취한 수있는 동안 미리 임상 '창'을 감당할 것입니다. 우리는 본 MRI-감지 대비 에이전트 역할 superparamagnetic 철 산화물 (SPIO) nanoparticles에 avidly apoptosis의 초기, 가역 단계에서 세포에 바인딩 인간 Annexin V (ANX)를, 어원이 같은 말하는 간단하고 강력한 방법을 제시. 활용 방법은 SPIO의 다당류의 껍질에서 카르 복실 그룹을 산화 SPIO의 nanoparticles의 산화로 시작합니다. ANX 단백질 투석을하는 것은 다음 줄이는 버퍼에 SPIO로 ANX의 공유 결합 상호 작용을 촉진하기 위하여 나트륨 borate 솔루션의 설정에 추가됩니다. 나트륨 borohydrid와 최종 감속 단계전자는 감소를 완료하기 위해 수행되는 다음 반응은 침묵하고 있습니다. Unconjugated ANX는 microcentrifuge 여과에 의한 믹스에서 제거됩니다. ANX-SPIO 제품의 크기와 순도는 동적 광 산란 (DL을)에 의해 확인됩니다. 이 방법의 외에도, 또는 수정을 요구하지 않는 등 교차 연결된 철 산화물 입자 활용 방법이나 비오틴-라벨 nanoparticles에 반대 다당류 SPIO 껍질. 따라서이 방법은 관심의 다른 단백질의 활용으로 연장될 수있다 간단 강력한 접근 방식을 나타냅니다.
Protocol
이전 연구 1에서 적응.
1. SPIO에 Annexin V의 활용
- 2 : 0.15 M 나트륨 periodate (NaIO 4) (중량 비율 4시 1분 무게)와 솔루션 어둠 속에서 20 1 시간을위한 SPIO 입자 (오션 나노기술 주식 회사, 5 밀리그램 / ML) ° C를 산화.
- 20 ° C.에 0.15 M 나트륨 borate (나 2 B 4 O 7 10H 2 O)에 : ANX 단백질을 (체중 1시 1분 비율, 체중) 정화와 함께 12 시간을위한 산화 SPIO를 품어
- 연기 후드 나트륨 borohydride (NaBH 4)와 1 시간에 대한 혼합물을 절감하고 0.15 M 트리스-HCL과 끄다.
- 14,000 XG (75 μm의 기공 Microcon 필터, Millipore, Billerica, MA)에서 원심 분리하여 ANX-SPIO에서 무료 ANX를 분리합니다.
- 또한 마그네틱 구분 장치 (오션 나노기술 주식 회사)를 사용하여 언바운드 불순물을 제거하여 화합물을 수정하십시오.
- 필터 retentate (ANX-SPIO) 단백질 수준을 수량-80에서 브래드 포드 단백질 분석 및 점포별로 ° C에서 2 시에 1% 혈청 알부민과 프로 테아제 억제제 (정지 프로 테아제 억제제, 열 과학, 1-50 밀리그램 / MG ANX)와 0.1 M 트리스-HCL의 MG / ML.
2. 동적 라이트 산란
- 별도로 0.1의 광학 밀도에 PBS에서 SPIO와 ANX-SPIO를 희석하고 Zetasizer 나노 DL을 기계 (Malvern 주식, Worcestershire, 영국) 3에서 동적 광 산란에 의해 분석합니다.
- Z-평균 입자 크기와 polydispersity 지수 (PDI)로, 화합물을위한 monomodal 봉우리 (이상적으로) 구합니다. 혼자 철 산화물 nanoparticle의 DL을 - 측정된 크기로이 크기를 비교합니다. ANX-SPIO DL을 결과 동질 ANX-SPIO 수종 3 반영, 0.13 1 PDI와 78 nm의의 켤레축 입자 유체 직경을 보여주었다.
3. 세포 배양, 문화 Apoptosis의 유도 및 교양 세포의 MRI
- 문화 성인용 마우스 골수 mesenchymal의DMEM에서 편 세포 (mMSCs가) 10 % FBS와 선호 통과에 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신 (Invitrogen 주식 회사), 4월 20일에서 30일까지으로 보충.
- DOX (시그마, 0.9 %의 식염수에 1 ㎜, 미디어 1 μm의 농도) 12와 37 ° C에서 시간 변화에 대한 치료로 문화 세포의 apoptosis를 유도.
- ANX-SPIO (아래 3.4에서 설명)와 MRI 또는 TUNEL 얼룩 후 현미경을 사용하여 (APO-BrdUTM TUNEL 분석 키트, 분자 프로브 / Invitrogen, 유진, OR) 또는 ANX-FITC와 얼룩 후 중 하나를 사용하는 문화에 apoptosis의 양을 계량 (로슈, 스위스).
- 37 15 분 ° C. 들어, ANX-SPIO (명시된 바와 제외한 10 MG 단백질 / ML 매체)로 또는 무료 SPIO (5 밀리그램)의 동등한 무게와 세포를 분류 SPIO의 nanoparticles의 확산을 막기 위해 1퍼센트 아가로 오스 1 ML 4 개의 PBS와 시간, 오버레이를 씻으십시오. 요리의 MRI (아래 설명) 수행합니다. 또는 세포를 씻고 DOX 및 ANX-SPIO 라벨 이후 trypsinize 다음, 전지가 허용Eppendorf 튜브에 알약을 형성하고 있습니다.
4. 체외 MRI에서
- 체외 MRI 분석에 대한 표준 무릎 수신기 코일과 1.5 ~ 3 테슬라 GE Signa의 자극 스캐너를 사용하십시오.
- 반복 시간 (TR) 550 MS, 에코 시간 (TE) 10 MS, 플립 각도 15 °, 매트릭스 256 X 256, 현장 : 문화 요리 또는 튜브 한천 팬텀으로, 그리고 그라디언트 - 에코 철부지 그라디언트 시퀀스를 사용하여 이미지를 놓으십시오 의 뷰 3cm X 3cm, 슬라이스 두께 1.3 mm, 평균 횟수 (NEX) 2, 간격 0mm 5. 이미지 axially 고정 영역의 지역 -의 이익을 사용하여 T2 * 신호 손실 (ROIs) (예를 들어, 0.8 mm 2) 접시 세포 계층을 통해. 한천 팬텀에서 투자 수익 (ROI) 제어 신호를 사용하여 배경에 조정합니다. 유령을 둘러싼 공기의 신호에서 배경 소음을 측정합니다.
- [SI 샘플 투자 수익 (ROI)-SI 관리 투자 수익 (ROI)] / SI는 신호 강도가,, [배경 잡음의 SI의 SD]하고 MRI를 대비 대 노이즈 비율 (CNR 계산SD)는 표준 편차는 각 문화 음식값 계산되었다.
5. 대표 결과
체외에서 T2 * 신호 손실 측정은 신호 공극 유물이 생성됩니다 균일한 한천 팬텀과 기포의 부족을 필요로합니다. 이 유물은 SPIO의 정품 T2 * 신호 손실로부터 구분하기가 어렵습니다, 그리고 interpretable 결과에 중요합니다. 공기 유물의 예제뿐만 아니라 정품 철 산화물 T2 * 신호의 손실에 대해 그림 1을 참조하시기 바랍니다.
체외 배양 접시 이미징의 경우, 두께 약 1mm입니다 충분한 축 MRI 조각은, 적절하게 이미지를 전체 요리로 만들 수 있도록, 각 문화 접시에 한천 겔의 적절한 볼륨을 적용합니다. 그림 2는 예상 MRI 신호를 보여줍니다 한천에서 개별 문화 판에서. INT의 영역의 일부 신호 판의 가장자리에서의 변화 때문에 분석은 일반적으로있다erest이 고르지 않은 부분을 방지해야합니다.
그림 1. ANX-SPIO는 교양 신생아 쥐 cardiomyocytes에서 apoptosis를 감지합니다. 그림 1A는 제어 솔루션 (왼쪽 튜브), ANX-SPIO (중간 튜브) 및 DOX + ANX-SPIO (오른쪽 튜브)로 치료 pelleted 신생아 cardiomyocytes의 사진을 보여줍니다 . DOX의 갈색 색상 + ANX-SPIO 취급 세포, apoptotic 세포의 ANX-SPIO 화합물의 증가 보존을 반영을 적어 둡니다. 체외 MRI 영상에서 그림 1B는 DOX + ANX-SPIO 전지의 강한 T2 * 신호 손실을 보여줍니다. 또한, 공기 방울은 제 4 회 및 신호 ANX-SPIO의 무효, 그리고 CNR의 분석에 영향을 미칠 수와 비슷 5 일 Eppendorf 튜브 (소형 블랙 신호 무효) 사이에 볼 수있다.
그림 2. ANX-SPIO바인딩은 문화의 apoptotic 세포에 대한 구체적인 것입니다. 그림 2A는 ANX-SPIO의 낮은 농도 (오른쪽 각각 왼쪽)와 ANX-FLUOS 염색법이나 ANX-SPIO의 염색법 중 하나를 받게 문화 요리에서 apoptotic 쥐 신생아 cardiomyocytes를, 보여줍니다. 참고 다른 T2 형광 ANX (ANX-FLUOS) 및 ANX-SPIO 높은 수준의 대비 낮은 수준으로 취급되었다 apoptotic 세포의 * 신호 손실 (흑백 신호). 증가 T2 오른쪽 * 신호 손실이 높은 ASX-SPIO의 농도에 의해 오프 경쟁되었습니다 띄게 감소 ANX-FLUOS 신호와 연관되어 있습니다. 그림 2B는 ANX-SPIO 대 ANX-FLUOS 신호와 분리의 경쟁력 바인딩을 보여줍니다 상수, 나는 K. x 축은 로그 스케일에서 Annexin 단백질 농도를 나타냅니다.
영화 1. 보완을 보려면 여기를 누르십시오영화.
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Discussion
Annexin V로 SPIO를 링크에 대한 설명 활용 방법은 Annexin의 측면 체인 아민 그룹과 SPIO의 nanoparticle의 카르 복실 moieties을 이용. 구체적인 산화 환원 단계를 통해, 이들 화합물의 공유 결합 결합을 얻을 수 있고, 결과로 작용 nanoparticle을 격리 수 있습니다. 이 방법은 다른 단백질과 관심의 nanoparticles에 일반 수 있습니다.
가장 중요한 단계는 적절한 온도와 부드러운 믹싱으로 수행 산화와 환원 조건입니다. 낮은 수율은 불완전 산화 또는 여과 단계에서 제거된다 잔여 무료 Annexin V에 결과 감소에서 발생할 수 있습니다. 관심있는 다른 단백질에 적용하면 최적의 조건은 위의 설명과는 다를 수 있습니다. 하지만 일단 이러한 최적의 조건을 정의하고, 필터링된 무료 단백질은 무시할 금액 감소하고, 따라서 microcentrifuge 여과 m 있습니다불안은 쓸데없는된다. 사실, 과잉 여과 자체 필터로 특이 현상이 바인딩으로 인해 최종 화합물 수율을 줄일 수 있습니다. 이 경우 사전 필터링 필터를 통해 알부민 1퍼센트하면 필터에 복합 화합물의 특이 현상이 바인딩을 줄이고 수율을 향상시킬 것입니다. 최종 화합물의 분석을 DL을하고, 잘 여과물의 단백질 농도 측정으로 잔여 무료 단백질이 존재하는 경우를 결정하는 데 도움이됩니다.
최종 화합물 무료 SPIO의 존재는 또한 잠재적인 오염 물질이다. 이를 위해 DL을들은 순도를 확인하기 위해 고용되었다. DL을하여 monomodal 피크는 단수 철 산화물 수종을 보장하는 데 도움이됩니다. 무료 SPIO 혼자 46nm에서 뚜렷한 DL을 피크를 생산하고 ANX-SPIO의 준비에 존재 아니었어요.
bioconjugation을위한 몇 가지 방법을 정의 NA의 가교 같은 비오틴 - streptavidin 상호 작용이나 단백질과 같은 다른 결합 메커니즘을 채용 가능한 6-12 있습니다noparticles. 여기에 제시된 방법은 전문 nanoparticles를 사용하지 않고, 관심 단백질에 자석 nanoparticles의 활용을위한 강력하고 광범위하게 적용 가능한 접근 방법을 나타냅니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
건강, NHLBI 국립 연구소 (R & D, PY, PS).
미국 심장 협회 (JL).
스탠포드 대학 VPUE 그랜트 (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
