Summary
Tidig upptäckt av apoptos kan identifiera i riskzonen cellpopulationer i en mängd olika sjukdomar. Här visar vi en metod för att koppla ett tidigt apoptos-upptäckt protein (Annexin V) till en MRI-detekterbart järnoxid nanopartiklar (SPIO). Denna metod kan utsträckas till andra proteiner av intresse för att generera MR-detekterbara molekylära avbildningssonder.
Abstract
Cellulär apoptos är en framträdande egenskap hos många sjukdomar, och denna programmerad celldöd typiskt inträffar innan kliniska manifestationer av sjukdomen är uppenbara. Ett sätt att upptäcka apoptos i dess tidigaste, reversibla steg skulle ge en pre-klinisk "fönster" under vilka förebyggande eller terapeutiska åtgärder kan vidtas för att skydda hjärtat från permanenta skador. Vi presenterar här en enkel och robust metod för att konjugera mänskliga Annexin V (ANX), som ivrigt binder till celler i de tidigaste, reversibla stadier av apoptos, till oxid superparamagnetiska järn (SPIO) nanopartiklar, som fungerar som en MRI-detekterbart kontrastmedel. Konjugeringen Metoden börjar med en oxidation av SPIO nanopartiklar, som oxiderar karboxylgrupper på polysackariden skal av SPIO. Renat ANX protein tillsätts sedan i fastställandet av en natriumboratlösning att underlätta kovalent interaktion mellan ANX med SPIO i reducerande buffert. Ett slutligt reduktionssteg med natrium borohydride utförs för att slutföra reduktion och därefter stoppas reaktionen. Okonjugerad ANX avlägsnas från blandningen genom filtrering mikrocentrifug. Storleken och renheten hos den ANX-SPIO produkten verifieras genom dynamisk ljusspridning (DLS). Denna metod kräver inte utöver, eller modifiering av, polysackarid SPIO skalet, i motsats till tvärbundna partiklar av järnoxid konjugeringsmetoder eller biotin-märkta nanopartiklar. Som ett resultat av detta är detta förfarande en enkel, robust metod som kan utsträckas till konjugering av andra proteiner av intresse.
Protocol
Anpassad från tidigare studie 1.
1. Konjugering av Annexin V SPIO
- Oxidera SPIO partiklar (Ocean Nanotech Inc., 5 mg / ml) under 1 h vid 20 ° C i mörker i lösning med 0,15 M natrium-perjodat (NalO 4) (04:01 vikt: vikt-förhållande) 2.
- Inkubera det oxiderade SPIO i 12 h med renat ANX proteinet (1:1-förhållande, vikt: vikt) i 0,15 M natriumborat (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) vid 20 ° C.
- Reducera blandningen ytterligare under 1 h med natriumborhydrid (NaBH4) i ett dragskåp och därefter avbröts reaktionen med 0,15 M Tris-HCl.
- Separera den fria från ANX ANX-SPIO genom centrifugering vid 14.000 x g (75 ^ m por Microcon-filter, Millipore, Burlington, MA).
- Ytterligare förfina föreningen genom att ta bort obundna föroreningar med hjälp av en magnetisk separator enhet (Ocean Nanotech, Inc.).
- Kvantifiera filtret retentat (ANX-SPIO) proteinnivåergenom Bradford-proteinanalys och lagra vid -80 ° C vid 2 mg / ml i 0,1 M Tris-HCl med 1% serumalbumin och proteashämmare (Halt proteasinhibitor, Thermo Scientific, 1-50 mg / mg ANX).
2. Dynamisk ljusspridning
- Separat späda SPIO och ANX-SPIO i PBS till en optisk densitet av 0,1 och analysera genom dynamisk ljusspridning i en Zetasizer Nano DLS maskin (Malvern Inc., Worcestershire, England) 3.
- Erhålla monomodala toppar (idealt) för föreningen, med en Z-genomsnittliga partikelstorleken och polydispersitetsindex (PDI). Jämföra denna storlek att DLS-uppmätta storleken av järnoxiden nanopartiklar ensam. ANX-SPIO DLS Resultaten visade en konjugat diameter partikel hydrodynamisk av 78 nm med en PDI av 0,13 1, vilket återspeglar en homogen ANX-SPIO arter 3.
3. Cellodling, inducering av apoptos i kultur, och MR av odlade celler
- Kultur vuxna musbenmärg mesenkymala stem celler (MMSC: er) i DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen, Inc.), företrädesvis vid passage 20-30 april.
- Inducera apoptos i kultursupernatanterna celler genom behandling under varierande tider vid 37 ° C med DOX (Sigma, 1 mM i 0,9% saltlösning, 1 | iM koncentration i mediet) 12.
- Kvantifiera mängden apoptos i kultur antingen MRT med ANX-SPIO (beskriven i 3,4 nedan) eller använda mikroskopi efter TUNEL fläckar (APO-BrdUTM TUNEL Assay Kit, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) eller efter fläcken med ANX-FITC (Roche, Schweiz).
- Märka cellerna med ANX-SPIO (10 mg protein / ml medium förutom såsom anges), eller med en ekvivalent vikt av fri SPIO (5 mg), under 15 min vid 37 ° C. Tvätta 4 gånger med PBS, och överlagring med 1 mL av 1% agaros för att förhindra diffusion av SPIO nanopartiklar. Utför MRI av rätterna (beskrivs nedan). Alternativt, tvätta cellerna och Trypsinisera efter DOX och ANX-SPIO märkning, låt cellernabilda pellets i Eppendorf-rör.
4. In vitro MRI
- Använd en 1,5 eller 3 Tesla GE Signa EXCITE scanner med standard knäet mottagarspole för in vitro MRI analys.
- Placera odlingsskålama eller rör till ett agar fantom och bilden med en gradient-eko bortskämda gradient ordning: Repetition Time (TR) 550 ms, Echo Tid (TE) 10 ms, flip vinkel 15 °, matris 256 x 256, fält- of-view 3 cm x 3 cm, skiva tjocklek 1,3 mm, antal medelvärden (NEX) 2, avstånd 0 mm 5. Bilden axiellt genom cellskiktet på plattan för T2 * signalförlust, med användning av regioner av intresse (ROI) över en fast yta (till exempel 0,8 mm 2). Justera för bakgrunden genom kontroll ROI signal från agar fantom. Mäta bakgrundsbruset från signalen för den luft som omger fantom.
- Beräkna MRI Kontrast-till-brus-förhållande (CNR: [SI prov ROI-SI styrning ROI] / [SD i SI av bakgrundsljud], där SI är signal intensitet ochSD är standardavvikelse) beräknades för varje odlingsskål.
5. Representativa resultat
Mätning av T2 * signalförlust in vitro kräver en homogen agar fantom och bristen på luftbubblor, vilket skapar artefakt signalen ogiltiga. Denna artefakt är svårt att skilja från äkta T2 *-signal förlust av SPIO, och är avgörande för tolkningsbara resultat. Se figur 1 för ett exempel på en luft artefakt såväl som äkta järnoxid T2 * signalförlust.
För in vitro odlingsskål avbildning, tillämpa en lämplig volym av agargel till varje odlingsskål så att tillräckliga axiella MRI skivor, som är ca 1 mm tjocka, kan göras på ett tillfredsställande sätt avbilda hela skålen. Figur 2 visar den förväntade MRT signalen från individuella odlingsplattor i agar. Det är typiskt någon signalvariation vid kanterna av plattan, så analys av regioner av interest bör undvika dessa ojämna områden.
Figur 1. ANX-SPIO upptäcker apoptos i odlade neonatala råttkardiomyocyter. Figur 1A visar ett foto av pelleterade neonatala kardiomyocyter behandlade med kontrollösning (vänster rör), ANX-SPIO (mitten rör) och DOX + ANX-SPIO (höger rör) . Notera den brunaktiga färgen på DOX + ANX-SPIO behandlade cellerna, vilket avspeglar en ökad retention av ANX-SPIO förening i apoptotiska celler. Figur 1B In vitro-MRI-bilder visar den intensiva T2 * signalförlust av DOX + ANX-SPIO celler. Dessutom är en luftbubbla ses mellan den 4: e och 5: e Eppendorf-rör (liten svart signal void), vilket liknar den signal tomrum ANX-SPIO, och som kan påverka analysen av CNR.
Figur 2. ANX-SPIObindningen är specifik för apoptotiska celler i kultur. figur 2A visar apoptotiska råtta neonatala hjärtmuskelceller på kultur rätter, utsätts för antingen ANX-FLUOS färgning eller ANX-SPIO färgning, med låga och höga koncentrationer (vänster och höger, respektive) av ANX-SPIO. Notera att olika T2 * signalförlust (svart signal) av apoptotiska celler som behandlades med fluorescerande ANX (ANX-FLUOS) och låga nivåer jämfört höga nivåer av ANX-SPIO. Den ökade T2 * signalförlust till höger är associerad med en markant reducerad ANX-FLUOS signal, som har tävlat bort av högre ASX-SPIO koncentrationer. Figur 2B visar konkurrerande bindning av ANX-SPIO kontra ANX-FLUOS signal och dissociation konstant, K ^. X-axeln betecknar annexin proteinkoncentrationen i log-skala.
Film 1. Klicka här för att se extrafilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna konjugering metod för koppling till SPIO Annexin V utnyttjar sidokedjegrupper amin av annexin och karboxylgrupper i den SPIO nanopartiklar. Genom särskilda oxidations att minska steg kan kovalent bindning av dessa föreningar uppnås och den resulterande funktionaliserade nanopartiklar kan isoleras. Denna metod kan generaliseras till andra proteiner och nanopartiklar av intresse.
De mest kritiska stegen är de oxidation och reduktion betingelser, som utförs i lämpliga temperaturer och med försiktig blandning. Låg avkastning kan bero på ofullständig oxidation eller reduktion, vilket resulterar i restfribord Annexin V som avlägsnas under filtreringen steget. När den appliceras på andra proteiner av intresse, kan optimala betingelser variera från de som beskrivs ovan. Men när dessa optimala förhållanden definieras, den filtrerade fritt protein kan minska till en försumbar mängd, och därför mikrocentrifug filtrering may blir överflödiga. I själva verket kan överskott filtrering minska den slutliga föreningen utbyte på grund av ospecifik bindning till själva filtret. Om detta inträffar före filtrering 1% albumin genom filtret kommer att minska ospecifik bindning av den konjugerade föreningen till filtret och förbättra utbytet. DLS-analys av den slutliga föreningen, och även mätningar proteinkoncentration av filtratet, kommer att avgöra om kvarvarande fritt protein är närvarande.
Närvaro av fritt SPIO i den slutliga föreningen är också en potentiell förorening. För detta ändamål var DLS användes för att kontrollera renhet. En monomodal topp genom DLS bidrar till att säkerställa en enastående art järnoxid. Gratis SPIO producerar mindre en distinkt DLS topp på 46 Nm och var inte närvarande i ANX-SPIO preparat.
Flera alternativ för biokonjugering finns 6-12 som sysselsätter de alternativa konjugerande mekanismer, såsom biotin-streptavidin interaktionen eller protein tvärbindning av kundanpassade nanoparticles. Den metod som presenteras häri representerar ett stabilt, allmänt tillämpbar metod för konjugering av magnetiska nanopartiklar till proteiner av intresse, utan användning av specialiserad nanopartiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
