斑马鱼的胚胎细胞内细菌病原体感染

Summary

透明斑马鱼的胚胎已经证明有用的模型可视化和主机之间的先天免疫细胞和细胞内细菌病原体的功能，如研究的相互作用，

Abstract

斑马鱼（ 斑马鱼 ）胚胎越来越多地用于研究在宿主-病原体相互作用¹脊椎动物先天免疫系统的功能模型。先天免疫系统的主要类型的细胞，巨噬细胞和中性粒细胞，在胚胎发育的第一天前发展的适应性免疫反应的淋巴细胞的成熟。轻松获得大量的胚胎，其无障碍由于外部发展，胚胎和幼虫的光学透明度，广泛的遗传工具，广泛的突变资源和转基因记者线的集合，所有添加到多功能的斑马鱼沙门伤寒（伤寒沙门氏菌）和分枝杆菌模型。可以驻留细胞巨噬细胞，并经常被用来研究在斑马鱼胚胎的宿主-病原体相互作用。这两种感染过程细菌病原体是有趣的比较，因为S。鼠伤寒沙门氏菌感染是急性和致命的，在一天之内，而研究海鱼感染是慢性的，并可以成像幼虫第²阶段^，3。微注射到胚胎（ 图1）细菌的网站，确定是否感染将迅速成为全身或将保持最初的本地化。建立一个快速的全身性感染，可通过微注射直接进入血液循环，通过尾静脉注射后血岛，或通过居维叶，卵黄囊上广泛流通渠道的心连接到主干血管导管的细菌。 1 DPF，在这个阶段的胚胎有phagocytically活跃的巨噬细胞，但尚未成熟的中性粒细胞，注射进入血液岛是首选。居维叶管道为2-3 DPF时，胚胎也已经开发出功能（过氧化物酶产）中性粒细胞，注射优先为t他注射部位。研究，对局部感染的骨髓细胞的定向迁移，细菌可注入尾肌，耳泡，或后脑心室^4-6。此外，脊索，这似乎是一个结构通常无法髓细胞，是高度敏感的局部感染^7。高吞吐量应用的一个有用的替代方法是细菌注射到胚胎在受精后⁸小时的蛋黄。结合荧光的巨噬细胞或中性粒细胞的荧光细菌和转基因斑马鱼线创建理想的情况下，宿主 - 病原体相互作用的多色成像。这部影片的文章将描述与S.静脉和局部感染斑马鱼胚胎的详细协议鼠伤寒或M。海鱼细菌和随后与先天免疫系统的细胞相互作用的荧光成像。

Protocol

1。准备注射针头

1. 准备硼硅玻璃微毛细管注射针头（哈佛仪器，300038，1毫米外径×0.78 mm内径），使用微量拉拔设备（萨特仪器公司，火焰山/布朗P-97有一个较长的尖端以下设置：气压400; 610热拉40，速度50，30日和时间较短的尖端以下设置：气压500热510拉100速度200;时间60）。
2. 用细镊子折断的针头，以获得尖端张开直径5-10微米。这是明智的伞在45度角与microgrinder（Narishige公司，EG-400），以产生一个清晰的尖针尖开幕。这将有助于刺破表皮层，从而导致组织损伤小于钝针，可重复注射。不再尖尾静脉（步骤5）和居维叶（步骤6.1）管注射和短尖的针针的首选其他注射协议（步骤6.2-6.6）为首选。

2。准备学鼠伤寒接种

1. 板出S。鼠伤寒从1 -80°C间甘油的LB琼脂平板上（用适当的抗生素选择荧光表达载体）孵育过夜37°C。
2. 挑选个别荧光阳性菌落，悬浮他们所需的浓度（见协议5和6）在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，可选含0.085％（V / V）酚红（Sigma-Aldrich公司），以帮助可视化注射过程。直接注入​​新鲜暂停使用或准备甘油股票。准备甘油库存，降速与细菌所需的浓度，新鲜的注射股票和股票集中重新悬浮颗粒在无菌的20％（V / V）甘油PBS（Sigma-Aldrich公司）开始量一半。存储在-8甘油股票0°C。稀甘油1:1（V / V）前注射无菌PBS，可选含0.17％酚红。
3. 涡菌悬液，以避免结块。
4. 装入微毛细管的使用的尖端microloader（Eppendorf公司，5242956.003）针接种。
5. 由于规模比较大的S.鼠伤寒菌和使用pGMDs3表达载体^3（可根据要求的应变）时，他们明亮的DS-红色荧光，个别细菌细胞可以很容易地计算用荧光体视显微镜，以设定的注射剂量。为此，注入的PBS下降1 NL琼脂平板上，计算荧光的细菌，并计算出需要的注射量，以获得所需的细菌剂量（最好保持在1-2 NL之间的注射量）。注射胚胎学鼠伤寒通过选定的路线（见协议5和6）。

3。准备

1. 保持的研究海鱼 Difco公司米德尔7H10琼脂上生长的应变（BD和公司）油酸10％白蛋白，葡萄糖氧化氢 ​​酶（OADC，屋宇署和公司），0.5％的甘油，并用适当的抗生素辅以荧光表达载体的选择（株可用^9）根据要求，所以始终是一个新鲜的股票。
2. 挑M 的殖民地海鱼和悬浮Difco公司米德尔7H9肉汤（BD和公司）与10％白蛋白，葡萄糖，过氧化氢 ​​酶（ADC，屋宇署和公司）和0.05％吐温80（Sigma-Aldrich公司）和适当的抗生素补充。检查，在600 nm的光密度值（OD值）为0.2 - 0.3，让它成长静态一夜之间在28.5°C。 M 的生成时间海鱼约4-6小时，变应变。
3. 测量在600 nm的OD再次注射一天。 1 OD600值相当于约10 ⁸ M.海鱼 /毫升（这可能会根据所使用的菌株不同，因此应根据一个特定菌株的生长曲线）。
4. 当他们在对数生长期，离心，洗涤他们三次在无菌PBS（不要让OD600值超过1.00），收获细菌。
5. 在PBS菌悬液的OD600值再次测量，旋转，悬浮细菌所需的浓度（见协议5和6）PBS或在2％聚乙烯吡咯烷酮（PVP40）在PBS（W / V），从而提高同质化细菌的悬浮液。酚红（Sigma-Aldrich公司）可以添加到0.085％的浓度，以帮助注射过程中的可视化。直接注入​​新鲜暂停使用或准备甘油股票。准备甘油库存降速注入新鲜的细菌所需的浓度股票和股票集中重新悬浮颗粒开始在无菌20％甘油的PBS体积的一半。储存的甘油埃罗尔股票在-80°C。稀释的股票在无菌PBS甘油1:1（V / V），可选含4％的PVP40和/或0.17％酚红。

4。准备注射的斑马鱼胚胎

1. 设置了斑马鱼的繁殖对收集胚胎在另一视频第¹⁰条所示。保持充满水蛋（60微克/毫升海盐;约60胚胎/皿）培养皿中的胚胎和孵化为28.5°C。
2. 如果需要，添加0.003％ 的 N-苯基（警察机动部队，Sigma-Aldrich公司），当胚胎蛋水约12 HPF，以防止黑色素。
3. 约24小时后施肥（HPF）dechorionate的的胚胎用细镊子（精细的科学工具有限公司，杜蒙＃5镊子 - Inox公司生物学。
4. 保持在培养皿中充满了蛋水和底部用1％琼脂糖层，以防止粘到塑料表面的胚胎的胚胎。
5. 麻醉胚胎200微克/毫升缓冲3- 对氨基苯甲酸（Tricaine，Sigma-Aldrich公司），以注射前约10分钟。

5。静脉注射细菌进入一日龄胚胎

1. ¹¹ 28 HPF胚胎阶段检查一致的血液循环，色素沉淀在眼，直尾，开始被定位的心只眼腹侧。
2. 麻醉的胚胎，见第4.5步。
3. 加载使用microloader尖端细菌接种针。
4. 安装到1连接到一个独立的微操作机器人（萨特仪器，MM-33）（世界精密仪器，M10L磁性底座）装针和定位下的立体显微镜（徕卡M50的消色差透镜1X目标0,15适用，透射光基地热释光街）。将注射时间和0.2秒的赔偿压力，以15百帕（Eppendorf公司，Femtojet）。调整注射压力之间的700和900百帕，以获得正确的针注射量使用。调整墨滴大小与一个在显微镜玻片上，或在眼比例尺的帮助下，以配合所需的直径。大小确定的下降可以注入矿物油，在显微镜幻灯片，或大小可以被注入到空气中，留下针尖上的下拉估计。 1 NL下降的半径是0.062毫米（：V = 4/3πR ^3）。
5. 设置到正确的位置显微操作与装针注射（即约45°角注射钢板表面）之前，仅来回移动注入。
6. 麻醉胚胎吸管到一个单位的1％琼脂糖注入板块和删除多余的蛋水，使表面张力保持在注射胚胎。使用的的头发环路工具（ 图2）排队胚胎。东方在注射注射用手工板放入胚胎的首选地位的inserti毫微针，即它们的尾巴朝针尖指向。
7. 直接将尾静脉泌尿生殖开幕（ 图1A），周皮与针尖刺穿接近以上的针头和注射所需剂量的细菌，我们使用CA。 250 CFU的S.鼠伤寒野生型（WT）SL1027株，包含DS-RED表达载体pGMDs3，CA。 120 CFU的研究海鱼应变Mma20。菌悬液注入将遵循通过尾静脉向心脏的血流量。监视是否正确进行检查数量扩张血管系统后直接脉冲²注射。对于剂量反应实验，可以进行连续注射2-3针无解压。
8. 经常检查，注射量在实验过程中保持不变。整个实验提供注射的一致性控制，注入了DRO供磷细菌直接进入细菌生长的培养基上的下降，大约每30 ^个胚胎注射后无菌PBS。盘出这个下降和孵化后的细菌菌落数在注射量确定的菌落形成单位（CFU）。
9. 使用荧光体视显微镜（协议）观察荧光与个人鼠伤寒细胞直接注射后血液循环，并丢弃不正确注射的胚胎。独立荧光研究海鱼细菌不能被直接注射后立体荧光显微镜观察，但感染细胞的荧光总量应该是由感染后2天（DPI）可见，随着时间的推移而增长较大。

6。感染的替代路线

1. 居维叶注射管起来麻醉胚胎平坦的1％琼脂糖为尾静脉注射注入板（见5.6）（2-3 DPF）。东方注入离子板的手在注射胚胎放置到首选位置插入针，即斜下，45°角，使居维叶管道可以通过从胚胎背侧的针尖接触（ 图1B） 。针插入居维叶管道，管道开始扩大在卵黄囊和注入100-200细菌（1-3 NL）的位置只是背起点。注射是正确的，如果管道内的体积扩展后直接脉冲和卵黄囊不破裂。为尾静脉注射（见5.7），可以进行连续几次注射而不提取针头。
2. 后脑脑室注射：一个单位的1％琼脂糖注射胚胎定位与他们针尖对背侧板等排队麻醉胚胎（32 HPF）。从前的位置插入针没有触摸到后脑心室neuroepithelium（ 图1C），注入20-100细菌（0.5-1 NL）。练习的过程中，使用荧光染料（如德州红葡聚糖）在另一视频第¹³条所示。
3. 尾肌注射位置为尾静脉注射麻醉胚胎（1-2 DPF）（见5.6）。与装针的微操作机器人调整到约65°角方面注射钢板表面。以上的泌尿生殖开幕（ 图1D）的肌肉，没有造成损害的脊索或血管注射含有细菌的悬浮液（0.5-1 NL）20 - 50 CFU。
4. 奥迪泡注射位置为尾静脉注射麻醉胚胎（2-3 DPF）（见5.6）。与装针的微操作机器人调整到约65°角方面注射钢板表面。注入的耳泡（ 图1E）低，按大约20个细菌（0.5 NL）余吕杏茜，以避免局部组织破裂。
5. 脊索注射：一个单位的1％琼脂糖凝胶注射板等，胚胎定位与他们的尾巴从针尖指向排队麻醉胚胎（1-2 DPF）。通过尾部肌肉组织进入脊索（ 图1F）插入针和注入约20-50细菌（最大0.5 NL）。照顾不能注入太多的量，以避免破裂的脊索。
6. 蛋黄注射位置鸡蛋含1％琼脂糖注射模具通道¹²或在线在矩形或V形通道板在16日至1000细胞阶段的胚胎http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html 。皮尔斯针通过的蛋壳到蛋黄（ 图1G）中心，并注入20-40细菌（1-2 NL）。 2％PVP40载波解决方案使用的菌悬液（见步骤3.5）重要的是防止细菌传播早期胚胎。

7。立体成像的感染

1. 麻醉在1％琼脂糖分层Petri网与含Tricaine（见4.5）的鸡蛋水盖菜感染胚胎。
2. 对齐头发环路工具（ 图2）与荧光体视显微镜下成像的正确位置的胚胎。鳔已充气前（1-5 DPF），胚胎将趴在自己的两侧扁平，使侧视成像。
3. 比侧视不同的位置，如果需要，安装在1.5％甲基纤维素的胚胎。到所需的位置与发循环工具（ 图2）操纵胚胎。
4. 返回胚胎蛋水后成像。

8。共焦成像的感染

1. 低熔点琼脂糖（龙沙公司，1.5％，蛋水（W / V））上的玻璃底部放置一个下降碟WillCo（WillCo井，GWSt-5040），如果使用共聚焦显微镜倒置，或如果使用一个直立的共聚焦显微镜幻灯片（琼脂科学，L4090）上的单腔抑郁。
2. 放入琼脂糖滴麻醉胚胎蛋水的数量有限，进入头发循环工具（ 图2）的位置和操作的胚胎。当使用倒置显微镜重要的是，胚胎的地区的利益是对成像菜的玻璃底平。一个堂堂正正的显微镜，用开水浸泡或长途干目标相结合，可用于胚胎应定位等，该地区的利益是尽可能接近目标。
3. 让琼脂糖巩固和淹没在鸡蛋水含Tricaine（见4.5）的琼脂糖下降。如果一个堂堂正正的显微镜，将盖玻片上的抑郁症腔（不允许有气泡形成）的顶部。
4. 依次获得流感orescence和传输图像。
5. 小心取出胚胎用细镊子和琼脂糖胚胎放入鸡蛋水，如果它需要进一步的实验。

9。代表结果

注入鼠伤寒沙门氏菌或分枝杆菌的细菌在血岛的胚胎1 DPF迅速被巨噬细胞的吞噬结果。最近的的MPEG1基因已被确定为一个胚胎的巨噬细胞的忠实的 ​​标记，同时位与完善的巨噬细胞标记csf1r（FMS），而不是与MPX（MPO）和¹⁴ LYZ ^4，如中性粒细胞标记重叠。对细菌的吞噬功能的实时成像，我们用转基因株系，其中MPEG1子驱动荧光蛋白表达在巨噬细胞^14。这些转基因株系有MPEG1子f直接使用的绿色荧光蛋白基因，或采用双组分系统MPEG1启动子驱动激活枫基因融合（UAS的上游激活序列）的的GAL4识别序列的第二个转基因酵母GAL4转录因子的表达。注射血岛（协议5， 图1A）正确执行时，细菌会立即流经的血液循环和整个胚胎的蔓延。比较大的和DS-RED明亮的荧光标记与传播成像鼠伤寒菌可以直接用一个立体荧光显微镜（ 图3A），并聚焦成像在2 HPI显示，许多细菌荧光巨噬细胞的吞噬（ 图3B-C的 ）。低至25 CFU野生型与注射鼠伤寒杆菌的细菌会导致致命的感染，而类似的剂量细菌无毒小号的火车，如RA，可以清除胚胎的免疫系统^3。被用来确定转录反应与注射剂量为250 CFU在斑马鱼胚胎和鼠伤寒沙门氏菌感染，表现出强烈的促炎症基因的表达响应¹⁵诱导。相比之下，静脉注射的研究海鱼细菌不会引起强烈的亲炎症反应，但会导致持久性的感染，感染的巨噬细胞形成肉芽肿的初始阶段，这是结核病的重要标志，紧聚集。共聚焦成像的 Tg在这样的肉芽肿样的总和（MPEG1：EGFP）gl22线于5月^14日 DPI显示细胞生长的mCherry标记的研究海鱼细菌内绿色荧光巨噬细胞（ 图3D-E），。

OT她感染的途径是非常有用的，为不同的目的。细菌可以在32 HPF（ 图1C），这是一个没有巨噬细胞的车厢注入后脑心室。注射20-100 mCherry标记研究到这个车厢的海鱼细菌导致的巨噬细胞吞噬细菌（ 图4A）的快速渗透。另一种方法来研究先天免疫细胞的定向迁移是细菌注射到尾肌（ 图1D）。然而，尾肌注射，也可能导致组织损伤本身引起一些白细胞的吸引力。小心地注入耳泡（ 图1E）体积小（0.5-1 NL）时，可避免这种伤人的反应。这里使用的Tg（MPX：i114 EGFP）的第¹⁶行，注入约20 CFU 与所示耳泡成的鼠伤寒导致中性粒细胞的吸引力，在3 HPI（ 图4E）。脊索，这似乎是抗白细胞浸润，是一种宽容的车厢为M 的增长的海鱼突变注入其他组织⁷时，有很强的衰减;（ 图4F）。最后，早分枝杆菌注射海鱼成胚胎的卵黄提供了一种替代的方法来达到全身性感染。我们一般这些注射执行约16个细胞的阶段（ 图1G），但也可以在稍后阶段进行细菌注射到蛋黄（多达1000个细胞的阶段），或更早（1到8细胞阶段）合作，注射吗啉代^8。继蛋黄注射剂量20-40 CFU，M.海鱼细菌的传播，在几天内将胚胎组织和类似的观察后，常规的形式肉芽肿状集合体静脉注射法（ 图4G）。蛋黄注射方法不适合为 S 鼠伤寒沙门氏菌感染的，因为它的蛋黄中的快速增长，导致早期的杀伤力。卵黄感染的方法的研究海鱼感染将是高吞吐量的应用非常有用，因为它可以自动使用注射机器人^8。

图1。建立一个快速的全身性感染的概述用于建立在斑马鱼胚胎的全身或局部感染的注射方法。（AB）的静脉注射后血岛在1 DPF（一）执行到尾静脉或到居维叶管道DPF（2-3）。 （CE），巨噬细胞和中性粒细胞趋化学习的地方注射后脑心室1 DPF（三），在1-2 DPF（D）或耳泡在2-3 DPF（五）尾肌。 （六）创建一个显然是人迹罕至到吞噬细胞的感染的注射执行脊索1-2 DPF。 （七）注射创建一个早期的全身性感染与生长缓慢的细菌，如M.海鱼可以把蛋黄在16-1000细胞的阶段。所有图像被徕卡M165C，PLANAPO 1.0X连接到徕卡DFC420相机的（10446307徕卡0.8倍）。

图2。头发循环工具 。一个人的头发的一块循环到开放的巴斯德吸管插入和固定在超级胶水或TIPP-EX的地方。这提供了一个方便的工具，轻轻操纵脆弱的斑马鱼胚胎。

图3。静脉注射的红色荧光鼠伤寒沙门氏菌和分枝杆菌 。DS-RED标记与鼠伤寒沙门氏菌 SL1027细菌（AC）和mCherry标记研究海鱼 Mma20细菌（DE）的注入血岛的Tg（MPEG1：GAL4-VP16的）gl24; TG（UAS-E1B：枫）s1999t（AC）或TG（MPEG1：EGFP）gl22（DE）的斑马鱼胚胎在28 HPF。 （一）立体荧光和亮场的叠加图像显示与传播鼠伤寒 2 HPI（徕卡MZ16FA与徕卡DFC420C相机显微镜）的血液循环。 （BC）的共聚焦的Z-Stack的预测显示红色与鼠伤寒菌在2 HPI（塔塔咨询服务公司的SPE，徕卡HCX亚洲生产力组织的目标，40X 0.8适用）绿色巨噬细胞吞噬。细菌仍然外，还可以观察。 （四）共焦Z-Stack的投影显示肉芽肿样的总含研究海鱼 Mma20感染和未感染的巨噬细胞在5 DPI（徕卡TCS的SPE，HCX亚洲生产力组织的40倍0.8不适用）。巨噬细胞在绿色和红色细菌。 （五）共焦投影的单个巨噬细胞（绿色）的Z-Stack与细胞研究海鱼细菌（红色）。 D中描绘的白色矩形的面积成像具有较高的放大倍率目标（徕卡TCS的SPE，HCX的PL APO 63X 1.2不适用）。 scalebars：20微米。

图4。替代路线 （一）mCherry标记的研究 斑马鱼胚胎的感染。 海鱼 Mma20细菌注入后脑脑室32 HPF。荧光和传输覆盖图像显示在5​​ HPI（徕卡TCS的SPE，HCX PL萤光灯西藏自治区40.0x 0.7 NA）由巨噬细胞的吞噬mCherry标记的细菌。 （二）S鼠伤寒尾肌注入1 DPF。 3 HPI髓细胞注射部位（白色圆圈）景点由f^4，原位杂交（三），而在未注射胚胎通常在这个形态的网站有没有髓细胞luorescent。虽然胚胎不包含在这个阶段成熟的中性粒细胞，粒细胞的数量，可以区分表达巨噬细胞标记mfap4（红色）和表达的中性粒细胞标记MPX（绿色）（莱卡TCS的SPE，HC的PL FLUOTAR 10.0x 0.3不适用）。细菌荧光原位杂交过程中丢失后。 （四）DS-RED标记与鼠伤寒细菌注入耳泡的Tg（MPX：EGFP）i114斑马鱼在2 DPF。立体荧光和亮场图像叠加显示，MPX：绿色荧光蛋白标记的嗜中性粒细胞被吸引到受感染的耳泡在3 HPI（虚线椭圆），（五），而控制PBS注入耳泡的Tg（MPX：EGFP ）i114 斑马鱼不显示感染的耳已经吸引中性粒细胞sicle（虚线椭圆）（徕卡MZ16FA与徕卡DFC420C相机）。 （六）mCherry标记研究减毒E11的eccCb1 :: TN突变株¹⁷ 海鱼细菌注入脊索1 DPF。脊索内扩散成像在5 DPI（DC500相机徕卡MZ16FA显微镜）。 （七）mCherry标记研究海鱼 E11的细菌注入16细胞阶段的TG（fli1a：EGFP）的斑马鱼胚胎的黄线，表示血液和淋巴管内皮细胞的GFP。形成肉芽肿样病毒感染的细胞在尾部区域聚集在DPI（5徕卡MZ16FA与徕卡DFC420C相机显微镜观察，从⁸图像）。

Discussion

在这篇文章中所描述的感染方法经常被用来研究宿主先天免疫基因或细菌致病基因的功能。静脉微量注射方法（5和6.1协议）是最常用的此类研究。在尾静脉注射后血岛，是最方便的地点为静脉注射1日龄胚胎。作为尾静脉变得更加难以渗透在稍后阶段，我们更喜欢静脉注射部位的胚胎在2-3 DPF居维叶管道。在所有情况下，关键是一致的细菌数，应检查电镀注射接种菌落计数注入胚胎。必须考虑以下几个方面来实现可重复注射。首先，它必须有高品质的玻璃微毛细管注射针头。如果针尖过大，注入将创建足够大的穿刺孔出血发生和注入的细菌就会流出来的血液循环。其次，细菌必须直接注射进入血液循环。如果不是内静脉或注射液利差如果卵黄囊扩展到针尖，胚胎必须被丢弃的实验。第三，作为一个载体，注入研究 PVP40 海鱼将有助于防止细菌在玻璃针下沉。 PVP40提高了悬挂的同质化，导致整个注射时间更重现接种。 PVP40也可以用来为 S 鼠伤寒杆菌注射，但在这里是不那么重要，因为较大的规模和明亮的荧光细菌可以在实验过程中的视觉控制较注射接种。对于执业注射，我们建议使用酚红染料（1％V / V）或1微米（Invitrogen公司）不同颜色的荧光领域。一旦掌握技术，它需要大约30 minutES注入50-100胚胎，包括琼脂糖板对齐的胚胎和调整细菌的注射量所需的时间。

虽然是最常用的静脉注射进入血液岛（协议）或到居维叶（6.1协议）的管道，感染这个视频文章中所描述的替代路线已经证明有用的研究巨噬细胞和中性粒细胞趋化（协议6.2，6.3和6.4），研究减毒菌株（6.5协议）的增长，以适应高吞吐量的应用（6.6协议^）4-8斑马鱼感染模型。所述的微注射方法也可用于注射病毒^18，19，真菌孢子^14，20或原虫（玛丽亚Forlenza，个人通讯）。注射在这部影片的文章中描述的过程是一个有益的补充皮下的细菌注入zebr最近描述的过程afish胚胎^21。此过程被应用于研究组织表面发现有效的吞噬细菌，但由嗜中性粒细胞，吞噬细菌，在巨噬细胞，吞噬后的血液注入到充满液体的体腔的细菌或几乎无法。皮下注射胚胎定位相似，但为这个视频文章中所描述的尾部肌肉注射针插入皮肤下注入了体节的细菌。

重要的是要考虑微量注射本质上是一种人工感染途径。然而，早期胚胎，具有很高的耐外部暴露于细菌病原体。事实上，胚胎沐浴在菌悬液，浸泡实验，不能在我们手中²²重现。虽然一些胚胎可能成为感染后浸泡，我们已经观察到的死亡率和中明确一个大的变化离子之间的个别胚胎在这种检测炎症的标记基因。微注射在这篇文章中介绍的方法实现重复性感染和研究细菌与宿主先天免疫细胞相互作用特别有用。量化个别胚胎细菌感染的有效途径是感染胚胎的荧光图像分析与定制，专用像素量化软件^17，23。这种方法已被证明关联电镀感染胚胎后菌落计数结果。同样，每胚胎白细胞数量相对变化已在转基因白细胞荧光记者的数字图像分析量化，这种方法是适用于量化主机leukopoietic的响应感染^24。

主机先天免疫基因的功能，可以在体内有效地调查相结合的描述感染模型吗啉击倒。吗啉代是人工合成的反义寡核苷酸，针对特定的RNA和基因产物的表达减少到1 -细胞期斑马鱼的胚胎注入其他视频文章中^，有25本杂志¹⁰所示。在啉击倒研究，这是所有胚胎组相比上演正确细菌注射前非常重要的。这一点尤其重要，因为胚胎有一个发展中的免疫系统，随着时间的推移变得越来越能干。

目前可用来区分的主要先天免疫亚群，巨噬细胞和中性粒细胞在斑马鱼的胚胎中，有几个转的记者线。 MPX和LYZ发起人已用于生成记者行中性粒细胞^{16，26，27，}并在csf1r（FMS）和MPEG1发起人被用来产生巨噬细胞的记者^{，14，28。}虽然CSF此外在xanthophores表达1R（FMS），MPEG1表达完全是在巨噬细胞。在这部影片的文章显示，最近开发的MPEG1记者线条非常有用的成像巨噬细胞吞噬细菌。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290
Glycerol	Sigma-Aldrich	228210
Difco Middlebrook 7H10 agar	BD Biosciences	262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment	BD Biosciences	211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment	BD Biosciences	211887
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40)	Calbiochem	529504
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose)	Lonza Inc.	50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605))	Invitrogen	F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515))	Invitrogen	F8823