Summary
هذه الدراسة تتعلق بتطوير وتوحيد بروتوكول منهجي لتحديد قيمة على المدى الطويل (14 يوما) السمية المهلكة التي تمارسها المواد الكيميائية ومياه الصرف الصناعي أو الصرف الصحي والعينات البيئية السائل على القشريات في المياه المالحة،
Abstract
أنشطة البحث هدفنا في استخدام الطرق البيولوجية لتقييم نوعية البيئة، مع إشارة خاصة إلى المياه المالحة / الماء الأجاج والرواسب. ويجب أن يستند اختيار المؤشرات البيولوجية على المعرفة العلمية الموثوقة، وربما على مدى توافر إجراءات موحدة. في هذه المقالة، فإننا نقدم لبروتوكول الموحدة التي تستخدم القشريات البحرية الأرتيميا لتقييم السمية للمواد الكيميائية و / أو من المصفوفات البيئية البحرية. العلماء أقترح أن الأرتيميا (Artemia) هو مرشح مناسب لوضع معيار الاختبار الأحيائي للاستخدام في جميع أنحاء العالم. وقد تم نشر عدد من ورقات عن التأثيرات السامة للمواد الكيميائية المختلفة والمواد السامة على الأرتيميا (Artemia). والميزة الرئيسية لهذه القشريات لإجراء دراسات سمية هو توافر العام للالخراجات الجافة، ويمكن استخدامها على الفور في هذه الاختبارات وليس طالب زراعة صعب
Protocol
1. الطريقة القياسية
تجاربنا ينطوي على تعريض يرقات الأرتيميا على فاصل زمني من تركيزات مادة أو عينة اختبار لغرض تحديد مستويات تركيز أو التخفيف من شأنها أن تتسبب في وفاة 50٪ من الكائنات الحية (LC 50) تعرض أكثر من 14 يوما، واستيفاء الشروط المحددة بواسطة هذه الطريقة. إذا كان ذلك ضروريا وممكنا، يمكن أيضا أن تحدد ما يلي: أ) مستوى تركيز الذي يتسبب في وفاة 20٪ من الكائنات الحية تتعرض (LC 20)؛ ب) أعلى مستوى تركيز تحليلها الذي لا تحديد معدل وفيات أعلى من تلك التي سيطرة سلبية (NOEC)؛ أدنى مستوى تركيز المجربة التي تحدد، بعد 14 يوما، وهو معدل وفيات أعلى من ذلك للسيطرة سلبية (أدنى مستوى تركيز ملاحظ).
2. اختبار المواد
2.1 بيض الأرتيميا
لأداء الاختبار، والأرتيميا franciscana 5. بيض مصدق أو الأكياس المستخدمة لدعم التجارب متاحة تجاريا، على سبيل المثال من قسم البحوث ضمان الجودة، الولايات المتحدة وكالة حماية البيئة، OH 45268 سينسيناتي، الولايات المتحدة الأمريكية أو من مختبر للأبحاث البيولوجية في التلوث المائي، جامعة غينت، بلجيكا.
2.2 الماء تخفيف
ويمكن استخدام المياه المالحة والمياه الاصطناعية التخفيف، التي أعدها حل المعترف بها الكواشف الجودة التحليلية أو صيغة متاحة تجاريا في الماء المقطر أو دي المؤينة. يمزج الملح لخلق المياه المالحة المثالي متاحة تجاريا، على سبيل المثال خليط المحيط فورية. فمن المستحسن من الماء مع تخفيف ملوحة تساوي 35 (± 2) جامعة الأمير سلطان، فضلا عن تركيز الأكسجين الذائب في أكثر من 80٪ من قيمة التشبع ودرجة حرارة 25 (± 2) ودرجة؛ جيم بعد تهوية لمدة 48 ساعة والترشيح في مرشحات مع المسامية ما لا يقل عن 0.45 ميكرون، قد يتم تخزين تخفيف لمدة أقصاها 30 يوما في الظلام في درجة حرارة 0-4 درجة مئوية.
2.3 ثقافة الطحالب
فمن المستحسن أن الكائنات الحية هي اختبار تتغذى على الطحالب tertiolecta Dunaliella، التي تنمو باطراد وتصل كثافة 1.3x10 6 - 2.0x10 6 خلية / مل. تجارب على عينات بيئية يتطلب الثقافات مع كثافة أعلى من الخلايا 2.0x10 6 / مل 6. يقترح أن Dunaliella tertiolecta ينمو في وسائل الإعلام التي تحتوي على ثقافة مياه البحر (30 (± 2) PSU و 20 (± 1) درجة مئوية) مع اضافة العناصر الغذائية الأساسية والمعادن والفيتامينات. وذكرت بعض المؤشرات عن تكوين وسائل الإعلام وإعداد الطحالب في الملحق. ويقترح كثافة الخلية الأولي أن ما يقرب من 10 5 خلية / مل. الحفاظ على الثقافة الطحالب في الحرارة في غرفة 20 (± 1) درجة مئوية، ومضيئة مع مصابيح الفلورسنت 3000 (± 300) LX، مع نسبة الإضاءة من 16 ساعة من الضوء إلى 8 ساعات من الظلام.
ويمكن أيضا أنواع العوالق النباتية الأخرى يمكن استخدامها للتغذية ولكن سيكون من الضروري إجراء الدراسات المقارنة مع هذه الأنواع العوالق النباتية للعثور على "ما يعادل" الأنواع إلى tertiolecta Dunaliella، وذلك لأن الظروف التجريبية (مثل كثافة الخلية الأولية، والإضاءة الخفيفة، ودرجة الحرارة، وتكوين وسائل الإعلام والثقافة، وزمن التعرض) تتفاوت بين أنواع العوالق النباتية. وبالاضافة الى التسامح من الطحالب الدقيقة لملوثات مختلفة تحتاج إلى النظر فيها بسبب تأثيرات التلوث على نمو وتطور تأثير العوالق النباتية أيضا على الأرتيميا.
2.4 مرجع مادة
مادة مرجعية في هذا الاختبار هو كبريتات الصوديوم دوديسيل.
2.5 مختبر الأواني الزجاجية
ق ق = "jove_content"> وبالإضافة إلى معدات مختبر المعتادة، هناك حاجة إلى المواد التالية:
- حاويات الاختبار بما في ذلك 100 مل أكواب زجاج البورسليكات (18 لأداء الاختبار، و 18 لنقل الحلول).
- قارورة (مثل قارورة 500 مل) لتحضير محلول قياسي.
- ستة قوارير (على سبيل المثال 200 قوارير مل) لإعداد حلول الاختبارات.
- زجاج أو البوليسترين قطرها 5 سم أطباق بتري مع إزالة يغطي لاستخدامها لتفعيل الخراجات ونقل الأرتيميا من الطبق الفقس إلى حاويات اختبار.
- الزجاج الماصات باستور (مع نصائح من قبل تقريب لهب) لنقل يرقات.
- الزجاج حقنة عادية أو باستور ماصات 3 مل من البلاستيك القابل للتصرف (لا بد من تخفيض) لنقل الأرتيميا.
- بال micropipettes والممصات المدرجة لاعداد حلول الاختبارات.
- ست اسطوانات تخرج (على سبيل المثال 50 اسطوانات مل) لنقل حلول الاختبارات من القوارير إلى رانه اختبار حاويات.
3. كيس التنشيط
3.1. أطباق بتري تحتوي على الخراجات + صب الماء
لتوليد كائنات الاختبار، ويتم وضع 20 ملغ من الخراجات في طبق بتري تحتوي على 12 مل من الماء تخفيف قبل 48 ساعة من الاختبار.
3.2. حضانة في ضوء وفي الظلام
الحفاظ على طبق بيتري في 25 (± 2) درجة مئوية، وعلى 4000 (± 1000) لوكس (شمعة لكل متر مربع) كثافة الضوء لمدة ساعة.
3.3. استبدال المتوسطة باستخدام المجهر
بعد 24 ساعة، ويتم نقل اليرقات الفقس في طبق بيتري جديدة مملوءة بالماء الاصطناعي. يتم تنفيذ النقل باستخدام المجهر، وذلك باستخدام أي مصدر الضوء بحيث الفقس، يرقات موجه ضوئيا تهاجر نحو شعاع ضوء. ويستخدم الزجاج ماصة باستير لجعل نقل، وضمان أن فقط الوليدة AR يرقاته نقل وليس الأكياس أو اليرقات التي لا تزال في الأغشية.
3.4. حضانة في الظلام
يوضع طبق يحتوي على اليرقات في غرفة مظلمة 1 ثرموستاتي لمدة 24 ساعة على 25 (± 2) درجة مئوية.
4. إعداد حلول الاختبارات
4.1. وزن المادة إلى القارورة نقل +
فمن المستحسن أن يتم تحضير محلول قياسي من المواد الخاضعة للاختبار عن طريق إذابة 0.5 غرام من مادة في قارورة 500 مل. يتم تعبئة القارورة حتى مع الماء دي المتأينة أو المقطر ويحرك حل حتى يذوب تماما مضمون الاختبار. الحلول يجب أن تكون مستعدة في ذلك الوقت من استخدام إلا إذا لم يكن معروفا ما إذا كانت المادة غير مستقرة في حل. في هذه الحالة، قد تكون على استعداد لمعيار حل حتى قبل يومين من الاختبار.
4.2. إعداد مراقبة سلبية، مضيفا المياه وتخفيف واي الطحالبال ماصة 10 مل
مستعدة لسيطرة سلبية في قارورة (على سبيل المثال حجم 200 مل) عن طريق إضافة قسامة للتعليق الطحالب في المياه تخفيف بحيث يتم الحصول على كثافة من 10 5 خلية / مل.
4.3. إعداد حلول الاختبارات: إضافة ماء تخفيف والطحالب وحل القياسية
يقترح أن يتم إعداد حلول الاختبارات في خمس قوارير 200 مل عن طريق إضافة محلول قياسي إلى الماء في تخفيف الكميات المحددة بحيث يتم الحصول على التركيز المطلوب للاختبار. لتغذية الكائنات الحية، قد يتم استخدام aliquots من الطحالب Dunaliella تعليق tertiolecta، وأضاف من أجل التوصل إلى كثافة من الخلايا 5 10 / مل عند إعداد حلول الاختبارات. ويوصى للترتيب التالي من بالإضافة إلى ذلك: تخفيف المياه، تعليق الطحالب وحل القياسية. بعد إعداد حلول الاختبار، لديهم لاستخدامها في فحص في أقرب وقت ممكن.
4.4. نقل الحلول من القارورة للحاويات الاختبار، ثم إلى أطباق بتري
يتم إدخال كميات متساوية (50 مل) من حلول الاختبارات في الحاويات اختبار باستخدام اسطوانة تخرج. يتم إجراء ثلاث نسخ طبق الأصل عن كل تركيز. لكل سلسلة من الاختبارات، يتم إعداد حاوية تحكم مع تخفيف كمية المياه مساوية لحجم حلول اختبار. يتم إدخال كميات متساوية (حوالي 12 مل) من الحلول اختبار في أطباق بتري. لكل سلسلة من الاختبارات، يتم استخدام طبق بيتري السيطرة.
5. التحضير للاختبار
5.1. يرقات في المرحلة الثانية والثاني والثالث
ثمان وأربعين ساعة بعد تفعيل كيس، ويرقات تصل إلى مرحلة اليرقات الثاني والثالث وصالحة للاستعمال بعد ذلك للاختبار.
5.2. يرقات نقل في أطباق بتري باستخدام المجهر
طبق بيتري المستخدمة في كيس يؤخذ التنشيط للخروج من غرفة الحراري. يتم نقل كمية صغيرة من اليرقات في أطباق بتري تحتوي على مراقبة والحلول الاختبار. هذه المهمة التي يتعين القيام بها مع المجهر باستخدام ماصة قطرها واسع بما فيه الكفاية بحيث لا تحصل على تضررت الكائنات الحية. في هذه المرحلة من اختبار، قد يتم تنفيذ نقل مع ماصة باستير الزجاج (مع طرف تقريب بواسطة لهب) ومصدر ضوء وضعه أفقيا تشجع على الأرتيميا إلى الكلي.
5.3. يرقات النقل من أطباق بتري في حاويات اختبار مع المجهر
يتم نقل اليرقات عشر من أطباق بتري اختبار حلول للحاويات الاختبار. أيضا هذه العملية يجب أن يؤديها من خلال الاستفادة من ماصة باستير والمجهر. فمن المستحسن أن يتم نقل وحدة تخزين لا تزيد عن 1 مل أثناء مرور اليرقات لا تؤثر على الحجم الكلي للنظام اختبار.
e_step "> 5.4. حاويات كاملة مغطاة parafilmوتغطي الأكواب اختبار مع parafilm (مما يترك فجوة لمرور الهواء)، والمحافظة على درجة حرارة 25 (± 2) درجة مئوية لمدة كاملة من الاختبار وعلى إضاءة 1 من 900 (± 100) LX مع الإضاءة نسبة من 14 ساعة من الضوء إلى 10 ساعة من الظلام.
6. استبدال الملحق المتوسطة والغذاء
6.1. معدل بقاء السيطرة
بعد يومين من الاختبار قد بدأ، ثم بعد أيام 5 و 7 و 9، و 12، ويلاحظ على الأرتيميا تحت المجهر للتحقق من معدل البقاء على قيد الحياة، والاستعاضة عن المتوسطة والمكملات الغذائية.
يتم حساب عدد من الكائنات الحية في كل وعاء اختبار. بعد مراقبة تحت المجهر والتحفيز الميكانيكي طفيف (مثل لمس اليرقات مع ماصة باستير الزجاج) الكائنات الحية التي لا يمكن أن تظهر بعض الحركة لنحو 10 قوينبغي النظر في econds الميت.
6.2. إعداد حل اختبار العينات تبين الطحالب مع ماصة 10 مل وأخذ عينات من المادة المراد اختبارها مع micropipette. نقل الحلول من القارورة إلى حاويات اختبار
بينما الاختبار، لا بد من الحلول محل اختبار دوريا، وعلى استعداد في نفس اليوم كما هي ليتم استخدامها. يتم إجراء اختبار الحلول من حل معيار أعدت مسبقا.
6.3. الأرتيميا نقل، وذلك باستخدام قطع ماصة باستير، عن الحاويات اختبار القديم إلى ثلاث حاويات جديدة
يتم تنفيذ نقل الأرتيميا باستخدام ماصة يبلغ قطرها واسع بما فيه الكفاية بحيث لا تضر الكائنات الحية. خلال هذه المرحلة، قد يتم استخدام 3 مل من البلاستيك ماصة باستير (لا بد من تخفيض).
6.4. اليرقات في دورق يحتوي على الأرتيميا إما حية أو ميتة
بعد 1 4 أيام من التعرض في نهاية الاختبار، ويتم احتساب عدد الباقين على قيد الحياة اليرقات وسجلت في ورقة العمل. LC 50 و / أو LC 20، وتحسب NOEC وأدنى مستوى تركيز ملاحظ في 14 يوما، وتسجيلها، وكذلك حدود الثقة في 95٪ من حيث الأساليب المناسبة، وحساب.
7. ممثل النتائج
في نهاية التجربة (14 يوما)، وحساب النسبة المئوية للوفيات في كل تركيز، وفقا للمعادلة التالية:
(M S / N) * 100
حيث:
ق م هو متوسط عدد أفراد لقوا حتفهم في تحليل عينة
N هو إجمالي عدد الأشخاص الذين تعرضوا
الجدول 1 التقارير على سبيل المثال من البيانات لاختبار (14D) مع الأرتيميا تتعرض لكبريتات الصوديوم دوديسيل.
| تركيزات (ملغم / لتر) | "> عدد من الأشخاص لقوا حتفهم في كل طبق الاصلمعدل الوفيات (٪) | |||
| أنا | II | ثالثا | ||
| السلبية السيطرة | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1.56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3.12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6.25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12.5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
وعلاوة على ذلك، وتحديدLC 50 القيمة من خلال مؤامرة التمويه رسومية لوغاريتمي أو باستخدام الأساليب الإحصائية المناسبة (على سبيل المثال، سبيرمان Karber أو الطريقة الاحتمالية). حساب LC 50 للبيانات من الجدول رقم 1 هو 8.18 (7،15-9،37) ملغم / لتر. إذا كان تركيز أقصى اختبارها تسبب في انخفاض معدل الوفيات من 50٪، لا يجب الشروع في احتساب القيمة 50 LC التي ستكون بعد ذلك لا يمكن الاعتماد عليها أو حتى غير محسوب. في هذه الحالة، ومع ذلك، يكون من المناسب لتكرار التجربة من خلال توسيع نطاق من تركيزات التي تم اختبارها. بدلا من ذلك، وأكثر بشكل صحيح عن قيمة ال 50 LC كما أكبر من أعلى تركيز اختبارها، مما يدل ربما على نسبة مئوية من معدل الوفيات على أعلى تركيز اختبارها وأعلى تركيز المقابلة لتأثير لا.
وتعتبر نتائج صحيحة إذا في نهاية اختبار الشروط التالية قد استوفيت:
- التحكم في معدل وفيات الأطفال في المتوسطغير ≤ 20٪؛
- حيث يتم تضمين باستخدام كبريتات الصوديوم دوديسيل، وLC 50 في 14 يوما في 8.0 (± 5) ملغم / لتر الفاصلة.
إذا لم يتم تلبية الشروط المذكورة أعلاه، ينبغي النظر في جميع البيانات التي تم الحصول عليها مع نفس دفعة من الكائنات الحية غير صحيحة وتكرار التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أرتميا هو واحد من الكائنات الحية اختبار أثمن متوفرة للاختبار السمية والأبحاث التي أجريت حتى الآن يسمح لنا بأن نقول انه من الممكن للحفاظ على العديد من الخيارات المتعلقة باستخدام الأرتيميا في علم السموم والسمية الإيكولوجية. الصفات التي تحول هذا الكائن إلى نوع مناسب للاختبارات بيولوجية هي: التوزيع الجغرافي الواسع والقدرة على التكيف عالية للظروف البيئية المعاكسة والمواد الغذائية المتنوعة، بسيطة نسبيا ثقافة المختبر والصيانة، ومقاومة للتلاعب، وباختصار دورة الحياة، كبير إنتاج ذرية و وجود كمية كبيرة من المعلومات حول بعض الأنواع. يشار إلى انتقادات ضد استخدام الأرتيميا لحساسيتها إلى التعرض للمواد الكيميائية: دراسات سابقة تشير الأرتيميا (اختبار التعرض للساعات 24) كنوع أقل حساسية للدراسات السمية، بالمقارنة مع الكائنات الأخرى في ظل ظروف الاختبار التجريبي نفسه 3. اختيارطريقة لاختبار السمية أمر بالغ الأهمية في هذا الصدد. أردنا أن توحيد طريقة التي لديها نفس الظروف بدءا (يرقات كما كائن اختبار، تم الحصول عليها من استخدام الأكياس) من البروتوكول إلى 24 ساعة من التعرض لل4، ولكن مع أوقات التعرض الطويل نسبيا (14 يوما) يمكن أن يوفر أكثر استجابة الحساسة. هذا البروتوكول يسمح بالتأكيد رد فعل أكثر حساسية من الاختبارات الحاد ولكن لا يمكن أن تستخدم كبديل لاختبار مزمن بسبب التعرض لمدة 14 يوما ليست ذات الصلة اذا ما نظرنا الى عمر تقدير من الأرتيميا. وقد تم اختيار نقطة النهاية لهذا الأسلوب مناقشة نطاق واسع. في البداية تم اختيار كل من وفيات والنمو (أي طول درع بعد 14 يوما من التعرض)، لأننا أردنا أيضا لضمان مراقبة تأثير شبه مميتة لإجراء اختبار على المدى الطويل. ومع ذلك، تم العثور على نقطة النهاية دون المميت أن تكون أقل حساسية بالمقارنة مع معدل الوفيات 6. لهذا السبب وفيات هي نقطة النهاية الوحيد المذكور في المكتويةايون من البروتوكول، وفي شريط الفيديو. هذا الاستنتاج يتساوق مع نتائج الدراسات من الباحثين الآخرين 7،8 الذي لاحظ أن البقاء على قيد الحياة هو المسار الأكثر خطورة من بين تلك التي نظر لها (البقاء على قيد الحياة والنمو والتكاثر).
الطريقة المقترحة هي مفيدة لتقييم سمية من النفايات السائلة، والمواد الكيميائية والمصفوفات البيئية 9. في ميزة قد يكون من المثير للاهتمام أن اختبار شبه قاتلة المزمنة الأخرى آثار سامة، مثل المؤشرات الحيوية (أي النشاط الأنزيمي) 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
التي تنتجها Manfra Loredana من معهد لحماية البيئة والبحوث (إسبرا، قسم مراقبة الجودة البيئية)، وفيديريكا Savorelli من الوكالة الإقليمية لحماية البيئة (إميليا رومانيا، إيطاليا).
الأعضاء المرجعية لمجموعة العمل الفرعية على القشريات الأرتيميا ضمن مجموعة الطرق البيولوجية - الماء المالح / الماء الأجاج والرواسب لجنة UNICHIM على نوعية المياه (معهد التشغيل التقييس التقني في قطاع المواد الكيماوية).
بالفيديو والتحرير بواسطة ماركو Pisapia من إسبرا (ويب وحدة).
تنسيق الانتاج آنا ماريا شيشرون واريكا Magaletti من إسبرا (قسم مراقبة الجودة البيئية).
نود أن نشكر الوكالة الإقليمية لحماية البيئة من إميليا رومانيا، فيرارا فرع، ومجموعة الطرق البيولوجية - المياه المالحة / الزعاقالمياه والرواسب لجنة UNICHIM على نوعية المياه وميغليوري لوسيانا، جامعة تور فيرغاتا (روما) لتعاونها؛ روسيلا Boscolo وماسيمو Gabellini من إسبرا (قسم الوقاية والتخفيف من الآثار) لدعمها المالي؛ Matassa وفابيو لندن مدرسة للغات في روما لما قدموه من دعم لغوي.
References
- Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
- Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).
- Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
- APAT IRSA-CNR. Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).
- Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
- Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica. Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).
- Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana. Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).
- Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA. Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).
- Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , UNICHIM. (2010).
- Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
