Summary
这项研究涉及了宝贵的方法论协议，以确定长期（14天）致死毒性化学物质，工业废水或污水和海水甲壳类的液体环境样品施加的发展和标准化，
Abstract
我们的研究活动的目标环境质量评价的生物学方法的使用，特别是海水/苦咸水和泥沙。生物指标的选择必须基于可靠的科学知识，可能的话，对标准化程序的可用性。在这篇文章中，我们提出了一个标准化的协议，用于海洋甲壳动物卤虫评估毒性化学品和/或海洋环境矩阵。科学家建议，丰年虾（ 卤虫 ）是一个合适的人选标准为全球利用生物测定的发展。已发表 的论文数量，丰年虾（ 卤虫 ）的各种化学品和毒物的毒性作用。这种毒性研究的甲壳类动物的主要优势是干囊肿的整体可用性，这些都可以立即在测试中使用和培养困难不要求
Protocol
1。方法标准
我们的测试，包括卤虫幼虫暴露物质浓度的时间间隔或确定的浓度或稀释会导致50％的生物体死亡（LC 50）超过14天暴露水平的目的为测试样品，并符合定义的条件用这种方法。如果必要和可能，也可确定如下：一）的浓度水平，导致死亡的20％（LC 20）暴露生物体;二）分析的最高浓度水平并不确定死亡率高于阴性对照组（NOEC）;测试的最低浓度水平的决定后14天，比阴性对照组（LOEC）死亡率较高。
2。材料试验
2.1 卤虫卵
执行测试， 卤虫franciscana 5获得。用来支持测试认证的鸡蛋或囊肿市售例如，从质量保证研究部，美国环境保护局，辛辛那提OH 45268，USA或污染水产品中，比利时根特大学生物研究实验室。
2.2水稀释
作为稀释水，可用于合成海水准备解散公认的分析质量试剂或蒸馏水或去离子水市售的配方。市售创造了理想的海水盐混合物，例如即时海洋混合物。建议用稀释水的盐度等于35（±2）电源供应器，以及超过80％的饱和值的溶解氧浓度和温度为25（±2）度; C.稀释后曝气48小时，并在孔隙率至少0.45微米的过滤器过滤，可存储最多30天在黑暗中，在温度0-4°C。
2.3藻类文化
建议测试生物体是杜氏tertiolecta微藻，饲料成倍增长，达到密度1.3x10 6 - 2.0x10 6细胞/ ml。环境样品的测试需要培养密度高于2.0x10 6细胞/ ml 6。建议， 杜氏tertiolecta生长在文化媒体含有海水（30（±2）PSU和20（±1）°），除了必需的营养素，矿物质和维生素。一些迹象表明藻媒体组成和准备报告附录中。建议初始细胞密度约10 5细胞/ ml。在保持藻类文化房间恒温在20（±1）°C间，与荧光灯3000（±300）LX与16小时的光照8小时黑暗的光照比，照亮。
其他浮游植物也可以被用来喂养，但有必要使这些浮游植物的比较研究，以找到“等同于”物种杜氏tertiolecta，因为实验条件（如初始细胞密度，光照，温度，组成浮游植物物种之间的文化传媒和曝光时间）不等。除了 需要考虑不同污染物的耐受性微藻，因为污染物对浮游植物的影响，也对卤虫生长和发展的影响。
2.4对照品
在本次测试的参考物质是十二烷基硫酸钠。
2.5实验室玻璃器皿
- 测试容器，包括100毫升的硼硅玻璃烧杯（18进行测试和传输解决方案18）。
- 一瓶酒（如500毫升瓶）准备标准的解决方案。
- 六瓶（如200毫升瓶）编写的测试解决方案。
- 包括被激活囊肿和卤虫孵化盘转移到测试容器使用玻璃或带有可拆卸的聚苯乙烯直径5厘米的培养皿。
- 玻璃巴斯德移液器（火焰四舍五入提示）为转移的幼体。
- 玻璃套管或巴斯德3毫升的一次性塑料移液器为转移卤虫 （削减）。
- 微电极和毕业移液器准备的测试解决方案。
- 6个量筒（例如，50毫升的气瓶）的转移烧瓶测试解决方案，到T他测试容器。
3。囊肿激活
3.1。培养皿中含有囊肿+倒水
要生成测试生物体，20毫克囊肿放入一个Petri测试前48小时内含有12毫升稀释水菜。
3.2。光在黑暗中孵化
培养皿维持在25（±2）℃和（±1000）4000勒克司（流明每平方米）一小时的光照强度。
3.3。更换介质使用显微镜
24小时后，孵化的幼虫被转移到一个新的Petri菜充满了人工水。使用显微镜，即使用一个光源，这样的孵化，的向光性幼虫迁移对光束进行转移。巴斯德玻璃吸管是用来做转移，确保只有新生幼虫ARé转移，而不是囊肿或幼虫仍然在细胞膜。
3.4。孵化中的黑暗
含有幼虫的菜被放置在一个黑暗的恒温室（24小时25±2）°C。
4。制备测试解决方案
4.1。称量物质+转移到容量瓶
它被推荐为测试物质的标准解决方案，是由溶解在500毫升容量瓶物质0.5Ğ准备。烧瓶充满了去离子水或蒸馏水，搅拌直到完全溶解的测试物质的溶液。解决方案已经在使用时要准备的，除非它不知道是否在溶液中的物质是稳定的。在这种情况下，标准的解决方案可能准备测试前两天。
4.2。准备阴性对照，加入稀释水和藻类的无线网络第10毫升吸管
准备在烧瓶（如200毫升体积）的取藻悬浮液中加入稀释水，使10 5细胞/ ml密度得到阴性对照。
4.3。准备测试解决方案：添加稀释水，藻类和标准溶液
据建议，准备加入标准的解决方案，所以，检测所需的浓度，得到指定数量的稀释水500 200毫升瓶测试解决方案。养活生物体，的杜氏tertiolecta的微藻暂停等分可能被添加到测试解决方案的准备时，达到10 5细胞/ ml密度。除下列顺序建议：稀释水，藻悬浮液和标准溶液。编写测试解决方案后，他们必须尽快在实验中使用。
4.4。传输瓶测试容器的解决方案，然后向培养皿
同等数量的测试解决方案（50毫升）引入测试利用量筒容器。每个浓度的三个副本。对于每个一系列的测试，控制容器的准备与测试解决方案的体积等于稀释水的用量。等量的测试解决方案（约12毫升）被引入到培养皿。对于每个一系列的测试，控制培养皿中被使用。
5。测试的准备工作
5.1。幼体在II-III期
囊肿激活后四十八小时，无节幼体达到Ⅱ - Ⅲ幼虫阶段，然后测试可用。
5.2。幼体转移到的Petri菜用显微镜
囊肿使用的培养皿激活取出恒温室。少量的幼虫转移到Petri网控制和测试解决方案的菜肴。这个任务是要进行显微镜利用一个足够宽直径的吸管，使生物体不损坏。在这个阶段的测试，可转让巴斯德玻璃吸管（圆尖火焰）和横向定位的光源，鼓励卤虫聚集。
5.3。幼体转移到测试容器的培养皿，在显微镜
十幼虫转移到测试容器测试解决方案，从培养皿。此操作也可以利用巴斯德吸管和显微镜进行。据建议，体积不超过1毫升的幼虫通过在不影响测试系统的整体体积。
e_step“> 5.4。容器用石蜡膜覆盖测试烧杯覆盖石蜡膜（留下机票的差距），并保持温度在25（±2）℃，整个测试时间为900（±100）lx的照度与光照14小时的光照至10小时的黑暗中的比例。
6。更换介质及辅食
6.1。成活率控制
两天后，已开始测试，然后5，7，9，12天之后， 卤虫验证的成活率和更换介质和辅食的显微镜下观察。
活生物体的数量，在每个测试容器。后在显微镜下观察和轻微的机械刺激（如触摸玻璃巴斯德吸管幼虫）不显示约10秒的一些运动的生物体econds应考虑死亡。
6.2。制备的藻类采样与10毫升吸管和微量测试物质的抽样测试显示解决方案。从烧瓶试验容器传输解决方案
测试时，测试解决方案必须定期更换，并在同一天，因为他们要使用准备。测试解决方案是由以前编制的标准溶液。
6.3 卤虫转移，从旧的测试容器，利用切巴斯德吸管，三个新的容器
用一个足够大直径的吸管，以免破坏生物体的转让卤虫进行。在此阶段，可用于3毫升塑料巴斯德吸管（削减）。
6.4。在烧杯中的幼虫含有任何活的或死的卤虫
经过1在测试结束4天的接触，存活幼虫的数量计算，并在工作表上的记录。 LC 50和/或LC 20，在14天的NOEC和LOEC，计算和记录，以及可信限在95％的地方，适当和计算方法。
7。代表结果
在测试结束（14天），计算每个浓度的死亡率的比例，按下列公式计算：
（男S / N）* 100
其中：
M S是死了个人的平均人数在分析样品
N是暴露的人的总数
表1报告的暴露，以十二烷基硫酸钠（14D）与卤虫的测试数据的一个例子。
| 浓度（毫克/升） | “> 在每个副本中死亡的个体数量死亡率（％） | |||
| 我 | 二 | 三 | ||
| 阴性对照 | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1.56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3.12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6.25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12.5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
此外，确定LC 50值由一个图形高斯对数图，或使用适当的统计方法（例如斯皮尔曼，寇式的Probit方法）。表1的数据计算的LC 50为8.18（7.15-9.37）毫克/升。如果最高浓度测试造成的死亡率降低50％，你不应该进行，这将是不可靠的，甚至非可计算的LC 50值计算。然而，在这种情况下，将适当延长测试浓度范围内重复测试。另外，更正确的LC 50值表示为大于测试的最高浓度，可能表明，在测试的最高浓度的百分比死亡率和相应的没有效果的最高浓度。
结果被认为是有效的，如果在测试下列条件已得到满足：
- 控制的平均死亡率≤20％;
- 其中包括在14天内使用十二烷基硫酸钠，立法会50在8.0（±5）mg / L的时间间隔。
如果上述条件没有得到满足，与生物体的同一批获得的所有数据应视为无效，反复测试。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
卤虫是迄今所做的生态毒性测试和研究提供最有价值的测试生物体之一，让我们来说明它是可以维持有关卤虫使用毒理学和生态毒理学的几个选项。这个有机体变成一个合适的物种生物测定的特点是：广泛的地理分布，恶劣的环境条件和不同的营养素，相对简单的实验室培养和维护，抗操纵，生命周期短，大型苗种生产和高适应性大量存在的一些物种的信息。反对使用卤虫的批评被称为其灵敏度化学品的接触：早期的研究是指为较不敏感的物种的生态毒性研究卤虫 （暴露试验，以24小时），当其他测试生物相比，在相同的实验条件。的选择生态毒性测试方法是在这方面是至关重要的。我们想，规范了同一起跑线条件的协议曝光4至24小时（无节幼体作为测试生物，从使用囊肿）的方法，但相对较长的曝光时间（14天）可以提供更灵敏的反应。这个协议肯定可以比急性毒性试验更敏感的反应，但它不能被视为一种慢性试验的替代品，因为14天的接触是不相关的，如果我们考虑卤虫的估计寿命。端点选择此方法已被广泛的讨论。最初死亡率和增长（即14天的暴露后的头胸甲长）被选中，因为我们还希望确保一个长期的测试的亚致死效应的观察。然而，亚致死终点被认为是不太敏感相比，死亡率6。出于这个原因的死亡率是唯一的端点中提到的不伦不类离子的协议和视频。这一发现与其他研究人员的研究7,8观察，生存是最敏感的端点之间那些认为他们（生存，生长和繁殖）是一致的。
该方法是有用的评估毒性化学品，废水和环境矩阵9。在功能，它可能是有趣的测试其他亚致死的慢性毒性作用，如生物标志物（即酶的活性）10。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
Loredana Manfra环境的保护和研究研究所（伊斯普拉部环境质量监测）区域环境保护署（艾米利亚 - 罗马涅，意大利）和Federica Savorelli产生。
海水/苦咸水和水质的UNICHIM委员会（在化工行业的技术标准化工作的机构）的沉积物- 卤虫甲壳类生物方法集团内的子工作组议员参考。
录像和编辑由马尔科，伊斯普拉Pisapia（网络单位）。
由安娜·玛丽亚·西塞罗和Erika伊斯普拉Magaletti的的环境质量监测部生产协调。
我们要感谢集团的生物方法费拉拉科，艾米利亚 - 罗马涅，环境保护的区域代理 - 海水/苦咸水水和泥沙的UNICHIM委员会对水质和卢西亚娜米廖雷，Tor Vergata大学（罗马）的合作;洛舍Boscolo和马西莫加贝里尼，伊斯普拉（预防和减轻影响）提供财政支持的法比奥Matassa和伦敦在罗马的语言学校，他们的语言支持。
References
- Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
- Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).
- Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
- APAT IRSA-CNR. Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).
- Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
- Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica. Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).
- Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana. Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).
- Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA. Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).
- Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , UNICHIM. (2010).
- Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
