Summary
Denne undersøgelse vedrører udvikling og standardisering af et værdifuldt protokol til at bestemme lang sigt (14 dage) dødelige toksicitet udøves af kemiske stoffer, industrielle spildevand eller spildevand og flydende miljø-prøver på saltvand krebsdyr,
Abstract
Vores forskningsaktiviteter rettet mod brug af biologiske metoder til vurdering af miljøkvalitet, med særlig henvisning til saltvand / brakvand og sediment. Valget af biologiske indikatorer skal være baseret på pålidelig videnskabelig viden og eventuelt, om tilgængeligheden af standardiserede procedurer. I denne artikel præsenterer vi en standardiseret protokol, der bruges det marine krebsdyr Artemia til at vurdere toksiciteten af kemikalier og / eller marine miljø matricer. Forskerne foreslår, at saltlage rejer (Artemia) er en egnet kandidat til udviklingen af en standard bioassay til verdensomspændende udnyttelse. En række papirer er blevet offentliggjort om de toksiske virkninger af forskellige kemikalier og giftstoffer på artemia (Artemia). Den største fordel ved denne krebsdyr for toksicitet er den overordnede tilgængeligheden af de tørre cyster, og disse kan umiddelbart anvendes til kontrol og er vanskeligt at dyrke ikke kræves
Protocol
1. Metode Standard
Vores test indebærer udsætte Artemia larver til et interval af koncentrationer af stoffer eller en prøve med henblik på at bestemme den opkoncentrering eller fortynding niveau, som ville medføre døden for 50% af de organismer (LC 50) udsættes for mere end 14 dage, og opfylder de fastlagte betingelser ved denne fremgangsmåde. Hvis det er nødvendigt og muligt, kan følgende også bestemmes: a) det koncentrationsniveau, der forårsager døden for 20% af de eksponerede organismer (LC 20), b) det højeste analyserede koncentration niveau, der ikke bestemmer en højere dødelighed end den negative kontrol (NOEC), den laveste testede koncentration, der bestemmer, efter 14 dage, en højere dødelighed end den negative kontrol (LOEC).
2. Testing Materials
2.1 Artemia æg
For at udføre test, Artemia franciscana 5. Certificerede æg eller cyster anvendes til støtte for test er kommercielt tilgængelige, fx fra Quality Assurance Research Division, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, USA eller fra Laboratoriet for biologisk forskning i vandforureningen, Universitetet i Gent, Belgien.
2,2 vandfortynding
Syntetisk saltvand kan anvendes som fortyndingsvand, fremstillet ved at opløse anerkendt analysekvalitet reagenser eller en kommercielt tilgængelig formulering i destilleret eller afioniseret vand. Salt blandinger til at skabe den ideelle saltvand er kommercielt tilgængelige, fx Instant Ocean blandinger. Det anbefales, fortyndingsvandet med en salinitet der er lig med 35 (± 2) PSU samt en opløst oxygenkoncentration på mere end 80% af værdien af mætning og en temperatur på 25 (± 2) oggrader; C. Efter beluftning i 48 timer og filtrering i filtre med en porøsitet på mindst 0,45 um, kan fortyndingen opbevares i op til 30 dage i mørke ved en temperatur på 0-4 ° C.
2,3 algekulturen
Det anbefales, at test-organismer er foder på Dunaliella tertiolecta mikroalger, der vokser eksponentielt og nå tætheder af 1.3x10 6 - 2.0x10 6 celler / ml. Test om miljøprøver kræver kulturer med tætheder højere end 2.0x10 6 celler / ml 6. Det foreslås, at Dunaliella tertiolecta vokser i en kultur medier, der indeholder havvand (30 (± 2) PSU og 20 (± 1) ° C) med tilsætning af essentielle næringsstoffer, mineraler og vitaminer. Nogle indikationer på alge medierne sammensætning og forberedelse er rapporteret i tillægget. Den initiale celledensitet foreslås at være omkring 10 5 celler / ml. Den algekulturen fastholdes i enrumtermostat på 20 (± 1) ° C, belyst med lysstofrør 3000 (± 300) LX, med en fotoperiode forholdet 16 timers lys til 8 timers mørke.
Andre planteplanktonarter kan også bruges til foder, men det ville være nødvendigt at foretage sammenlignende undersøgelser med disse planteplanktonarter at finde de "svarer" arter Dunaliella tertiolecta, fordi de eksperimentelle betingelser (f.eks indledende celledensiteterne, let belysning, temperatur, sammensætning af dyrkningsmedier og eksponeringstid) varierer blandt planteplanktonarter. Foruden tolerance af mikroalger til forskellige forurenende skal overvejes, fordi de forurenende virkninger på væksten og udviklingen af fytoplankton virkning også til Artemia.
2,4 reference stof
Referencestoffet i denne test er natriumdodecylsulfat.
2,5 Laboratory glas
- Test af containere, herunder 100 ml borsilicatglashulsfærer bægerglas (18 til at udføre test og 18 til at overføre løsninger).
- En kolbe (f.eks 500 ml kolbe) til fremstilling af standardopløsning.
- Seks kolber (f.eks 200 ml kolber) at forberede de test løsninger.
- Glas eller polystyren 5 cm diameter petriskåle med aftageligt betræk der skal bruges til at aktivere cyster og overføre Artemia fra klækning parabol til test containere.
- Glas Pasteur pipetter (med tips runde af flamme) til overførsel nauplii'erne.
- Glas kanyler eller Pasteur 3 ml engangs plast pipetter (skal skæres) til overførsel af Artemia.
- Mikropipetter og Justerede pipetter til at forberede test løsninger.
- Seks graduerede cylindre (f.eks 50 ml cylindre) for at overføre teste løsninger fra kolberne til tHan afprøvning beholdere.
3. Cyst Aktivering
3,1. Petriskåle indeholdende cyster + hælde vand
At generere testorganismer, der er 20 mg af cyster anbragt i en petriskål indeholdende 12 ml fortyndingsvand 48 timer før testning.
3,2. Inkubation i lys og i mørke
Petriskålen holdes ved 25 (± 2) ° C og ved en 4000 (± 1000) lux (lumen per kvadratmeter) lysintensitet i en time.
3,3. Udskiftning af mediet ved hjælp af mikroskop
Efter 24 timer er den udklækning larver overført til en ny petriskål fyldt med kunstig vand. Overførslen udføres ved hjælp af mikroskop, dvs ved hjælp af en lyskilde, således at klækning fototropisk larver migrere mod lysstrålen. Et glas Pasteur pipette anvendes til at foretage overførslen, hvilket sikrer, at kun den spirende larver ARe overført og ikke cyster eller larver stadig membraner.
3,4. Inkubering i mørke
Skålen indeholder larver anbringes i et mørkt termostatisk kammer i 24 timer ved 25 (± 2) ° C.
4. Udarbejdelse af Test Solutions
4,1. Vejning af stoffet + overføre til kolben
Det anbefales, at standardopløsningen for afprøvning stof fremstilles ved at opløse 0,5 g af materialet i en 500 ml kolbe. Kolben fyldes med deioniseret eller destilleret vand, og opløsningen omrøres, indtil testen stof er fuldstændigt opløst. Løsninger skal være forberedt på det tidspunkt, medmindre det ikke vides, om stoffet er stabilt i opløsning. I dette tilfælde kan standard opløsning forberedt op til to dage før testning.
4,2. Forberedelse af negative kontrol, tilføjer fortyndingsvand og alger with på 10 ml pipette
Den negative kontrol er fremstillet i en kolbe (f.eks 200 ml volumen) ved tilsætning af en alikvot af alger suspensionen til fortyndingsvandet, således at en densitet på 10 5 celler / ml opnås.
4,3. Forberedelse af test løsninger: tilsætte fortyndingsvand, alger og standard-løsning
Det foreslås, at testning opløsninger fremstilles i fem 200 ml kolber ved tilsætning af standardopløsningen for fortyndingsvandet i de anførte mængder, således at de ønskede koncentrationer af test opnås. At fodre organismer, kan portioner af en Dunaliella tertiolecta mikroalger suspension skal anvendes, og tilsat for at nå en densitet på 10 5 celler / ml ved test opløsninger fremstilles. Den følgende rækkefølge Desuden anbefales: fortyndingsvand, alge suspension og standard løsning. Efter fremstillingen af test løsninger har de skal anvendes i assayet så hurtigt som muligt.
4,4. Overførsel af løsninger fra kolben til test containere, derefter til petriskåle
Lige mængder (50 ml) af test løsninger er indført i test beholderne ved anvendelse af den måleglas. Tre kopier for hver koncentration er lavet. For hver serie af tests, er en kontrol beholder fremstillet med en mængde fortynding vand svarende til volumen af test-løsninger. Lige store volumener (ca. 12 ml) af testopløsningerne er indført i Petriskåle. For hver serie af forsøg, er en kontrol petriskål anvendes.
5. Forberedelse til test
5,1. Nauplii ved II-III fase
Otteogfyrre timer efter cyste aktivering nauplii'erne nå II-III larvestadiet og er derefter anvendes til testning.
5,2. Nauplier overførsel til de petriskåle ved hjælp af mikroskop
Petriskålen anvendes cyste aktivering er taget ud af den termostatiske kammer. En lille mængde af larver er overført til petriskåle, der indeholder kontrol og test løsninger. Denne opgave der skal udføres med mikroskopet under anvendelse af en pipette med tilstrækkelig stor diameter, så at organismerne ikke bliver beskadiget. I denne fase af testen, kan overførslen udføres med et glas Pasteur-pipette (med spids afrundet med flamme) og en sideværts placeret lyskilde, der tilskynder Artemia til at aggregere.
5,3. Nauplier overførsel fra petriskålene i test-beholderne med mikroskopet
Ti larver overføres fra de test løsninger petriskålene til test containere. Også denne operation skal udføres ved anvendelse af Pasteur-pipette og mikroskop. Det anbefales, at et rumfang som ikke overstiger 1 ml overføres under passagen af larver ikke at påvirke den samlede volumen af test-system.
e_step "> 5.4 fyldte beholdere dækket med parafilmPrøvnings bægerglas er dækket med parafilm (efterlades en spalte for luftpassage) og holdes ved en temperatur på 25 (± 2) ° C under hele forsøget og ved en belysning på 900 (± 100) lx med en fotoperiode forholdet 14 timers lys til 10 timer i mørke.
6. Udskiftning af Medium og kosttilskud
6,1. Overlevelse hastighedsstyring
To dage efter testen er startet, og derefter efter 5, 7, 9 og 12 dage, Artemia observeret under mikroskop for at kontrollere overlevelsesraten og at erstatte mediet og kosttilskud.
Antallet af levende organismer tælles i hver test beholder. Efter observation under mikroskopet og let mekanisk stimulering (fx berøre larver med et glas Pasteur-pipette) organismer, der ikke udviser nogen bevægelse i ca 10 sekunderindikator lyser overvejes død.
6,2. Fremstilling af en testopløsning, der viser alger sampling med en 10 ml pipette, og udtagning af det stof, der testes med en mikropipette. Overførsel af løsninger fra kolben til test containere
Mens test skal testopløsningerne udskiftes periodisk, og fremstilles på samme dag som de skal anvendes. Testopløsninger fremstilles af standardopløsningen tidligere fremstillede.
6,3. Artemia overførsel, udnytte en nedskæring Pasteur pipette, fra de gamle test containere til de tre nye beholdere
Overførsel af Artemia udføres ved anvendelse af en pipette med en tilstrækkelig stor diameter, så de ikke at beskadige organismerne. Under denne fase kan en 3 ml plastik Pasteur pipette (der skal skæres) anvendes.
6,4. Larver i et bægerglas indeholdende enten levende eller døde Artemia
Efter 1 4 dages eksponering i slutningen af test, er antallet af overlevende larver tælles og registreres i regnearket. LC 50 og / eller LC 20, er NOEC og LOEC på 14 dage, beregnes og registreres, samt konfidensgrænser på 95% i givet fald, og beregningsmetoder.
7. Repræsentative resultater
Ved slutningen af forsøget (14 dage), beregnes den procentvise dødelighed ved hver koncentration, ifølge den følgende formel:
(M S / N) * 100
Hvor:
M s er det gennemsnitlige antal af døde personer i den analyserede prøve
N er samlet antal eksponerede personer
Tabel 1 viser et eksempel på data fra en prøve (14d) med Artemia udsat for natriumdodecylsulfat.
| Koncentrationer (mg / l) | "> Antal døde personer i hver replikaDødelighed (%) | |||
| Jeg | II | III | ||
| Negativ kontrol | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1,56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3,12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6,25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12,5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
Desuden bestemmerLC 50-værdien af en grafisk gaussisk logaritmisk plot eller under anvendelse af passende statistiske metoder (for eksempel Spearman-Karber-eller probit-metoden). Beregning af LC 50 efter dataene i tabel 1 er 8,18 (fra 7,15 til 9,37) mg / liter. Hvis den maksimale testede koncentration skyldes en lavere dødelighed på 50%, bør du ikke fortsætte til beregningen af LC 50-værdi, som ville være upålidelig eller endog ikke-beregnelige. I dette tilfælde, ville imidlertid være hensigtsmæssigt at gentage testen ved at udvide testkoncentrationsområdet. Alternativt LC 50-værdi mere korrekt udtrykt som er større end den højeste afprøvede koncentration, hvilket muligvis indikerer procentdelen af mortalitet ved den højeste testede koncentration, og den højeste koncentration svarende til en nogen virkning.
Resultaterne betragtes som gyldige, i slutningen af teste de følgende betingelser er opfyldt:
- kontrol gennemsnitlige dødelighedsrateer ≤ 20%;
- hvor hjælp natriumdodecylsulfat, LC 50 efter 14 dage er inkluderet i 8,0 (± 5) mg / l interval.
Hvis ovenstående betingelser ikke er opfyldt, skal alle data opnået med samme batch af organismer betragtes som ugyldige og test gentages.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artemia er en af de mest værdifulde testorganismerne til rådighed for økotoksicitetsprøvning og forskning hidtidige giver os mulighed for at oplyse, at det er muligt at opretholde flere muligheder relateret til Artemia brug i toksikologi og økotoksikologi. De karakteristika, der bliver denne organisme i en egnet art til bioassays er: en bred geografisk fordeling, høj tilpasningsevne til ugunstige miljøforhold og varierede næringsstoffer, relativt simpelt laboratorium kultur og vedligeholdelse, modstandsdygtighed over for manipulation, kort livscyklus, store afkom produktion og de eksistensen af en betydelig mængde oplysninger om nogle arter. En kritik mod brugen af Artemia er henviste til sin følsomhed over for kemiske påvirkninger: tidligere studier refererer Artemia (test til 24 timers eksponering), som en mindre følsomme arter for OEkotoksicitetsundersoegelser, når der sammenlignes med andre testorganismer under de samme eksperimentelle betingelser 3. Valget afmetode til økotoksicitetsprøvning er afgørende i denne henseende. Vi ønskede at standardisere en metode, som havde de samme startbetingelser (nauplier som testorganisme, stammer fra brug af cyster), i protokollen til 24 timers eksponering 4, men med relativt lange eksponeringstider (14 dage) kunne give en mere følsomme respons. Denne protokol helt sikkert giver en mere følsom respons end de akutte tests, men det kan ikke bruges som erstatning for en kronisk test, fordi en udsættelse på 14 dage ikke er relevant, hvis vi betragter skønnet levetid Artemia. Slutpunktet selektion for denne fremgangsmåde er blevet bredt beskrevet. Oprindeligt både dødelighed og vækst (dvs. rygskjoldets længde efter 14-dages eksponering) blev valgt, fordi vi ønskede også at sikre observation af en subletal virkning for en langsigtet test. Blev imidlertid subletal slutpunkt sig at være mindre følsomme end dødelighed 6. Af denne grund dødelighed er den eneste slutpunkt nævnt i description af protokollen, og i videoen. Dette resultat er i overensstemmelse med studier af andre forskere 7,8 der observerede, at overlevelse er det mest følsomme endpoint blandt dem, der betragtes af dem (overlevelse, vækst og reproduktion).
Den foreslåede metode er nyttige til at evaluere toksiciteten af kemikalier, spildevand og miljømæssige matricer 9. I funktionen kan det være interessant at teste andre subletale kroniske toksiske effekter, såsom biomarkører (dvs. enzymatisk aktivitet) 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Produceret af Loredana Manfra af Institut for miljøbeskyttelse og forskning (ISPRA-Department of Environmental Quality Monitoring) og Federica Savorelli for Regional agenturet for Environmental Protection (Emilia-Romagna, Italien).
Referencemedlemmer for sub-arbejdsgruppe på Artemia krebsdyr inden for biologiske metoder Group - Saltvand / brakvand og sediment i UNICHIM Kommissionen om vandkvalitet (Institute for tekniske standarder, der opererer i den kemiske sektor).
Videography og redigering af Marco Pisapia af ISPRA (Web Unit).
Produktion Koordinering af Anna Maria Cicero og Erika Magaletti af ISPRA (Department of Environmental Quality Monitoring).
Vi vil gerne takke det regionale agenturet for miljøbeskyttelse af Emilia-Romagna, Ferrara Branch, den biologiske metoder Group - Saltvand / brakvandVand og sediment i UNICHIM Kommissionen om vandkvalitet og Luciana Migliore, Tor Vergata Universitet (Rom) for deres samarbejde Rossella Boscolo og Massimo Gabellini af ISPRA (Institut for Forebyggelse og afbødning af virkninger) for deres finansielle støtte; Fabio Matassa og London School of Languages i Rom for deres sproglige støtte.
References
- Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
- Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).
- Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
- APAT IRSA-CNR. Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).
- Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
- Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica. Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).
- Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana. Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).
- Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA. Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).
- Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , UNICHIM. (2010).
- Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
