Summary
Questo studio riguarda lo sviluppo e la standardizzazione di un protocollo valido strumento metodologico per determinare a lungo termine (14 giorni) tossicità letale esercitata da sostanze chimiche, delle acque reflue industriali o acque di scarico e liquidi campioni ambientali sul crostaceo d'acqua salata,
Abstract
Le nostre attività di ricerca incentrato sull'uso di metodi biologici per la valutazione della qualità ambientale, con particolare riferimento ad acqua salata / acqua salmastra e sedimenti. La scelta degli indicatori biologici deve basarsi su conoscenze scientifiche affidabili e, eventualmente, la disponibilità di procedure standardizzate. In questo articolo, vi presentiamo un protocollo standardizzato che ha utilizzato il crostaceo marino Artemia per valutare la tossicità delle sostanze chimiche e / o di matrici ambientali marine. Gli scienziati propongono che l'artemia (Artemia) è un candidato idoneo per lo sviluppo di un saggio biologico standard per l'utilizzo in tutto il mondo. Un certo numero di lavori sono stati pubblicati sugli effetti tossici di varie sostanze chimiche e sostanze tossiche sul artemia (Artemia). Il vantaggio principale di questo crostaceo per gli studi di tossicità è la disponibilità complessiva delle cisti secchi, questi possono essere immediatamente utilizzato nei test e la coltivazione difficile non è richiesto
Protocol
1. Metodo Standard
Il test consiste nel sottoporre larve Artemia ad un intervallo di concentrazioni della sostanza o di un campione di prova per determinare i livelli di concentrazione o diluizione che potrebbero causare la morte del 50% degli organismi (LC 50) esposto per 14 giorni e di soddisfare le condizioni definite con questo metodo. Se necessario e possibile, possono anche essere determinato: a) il livello di concentrazione che provoca la morte del 20% degli organismi esposti (LC 20), b) il più alto livello di concentrazione analizzato che non determina un tasso di mortalità più elevato di quello dei il controllo negativo (NOEC), il livello più basso concentrazione saggiata che determina, dopo 14 giorni, un tasso di mortalità più elevato di quello del controllo negativo (LOEC).
2. Prova dei materiali
2.1 uova di Artemia
Per eseguire il test, Artemia franciscana 5. Uova o cisti certificati utilizzati per supportare il testing sono disponibili in commercio, ad esempio, della divisione Research Quality Assurance, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, USA o dal Laboratorio per la ricerca biologica in fenomeni di inquinamento acquatico, Università di Ghent, in Belgio.
2,2 di acqua di diluizione
Salata sintetica può essere utilizzata come acqua di diluizione, preparata sciogliendo riconosciuti reagenti di qualità analitica o una formulazione disponibile in commercio in acqua distillata o deionizzata. Miscele di sale per creare l'acqua salata ideale sono commercialmente disponibili, ad esempio le miscele Ocean istantanea. Si raccomanda di acqua di diluizione con una salinità pari a 35 (± 2) PSU nonché una concentrazione di ossigeno disciolto superiore al 80% del valore di saturazione e una temperatura di 25 (± 2) egradi; C. Dopo aerazione per 48 ore e filtrazione in filtri con una porosità di almeno 0,45 um, la diluizione può essere conservato per un massimo di 30 giorni al buio a una temperatura di 0-4 ° C.
2,3 coltura di alghe
Si raccomanda che gli organismi test sono si nutrono di microalghe Dunaliella tertiolecta, che crescono in modo esponenziale e di raggiungere densità di 1.3x10 6 - 2.0x10 6 cellule / ml. La sperimentazione su campioni ambientali richiede culture con densità superiori a 2.0x10 6 cellule / ml 6. Si suggerisce che Dunaliella tertiolecta cresce in un terreno di coltura contenente acqua di mare (30 (± 2) PSU e 20 (± 1) ° C) con l'aggiunta di sostanze nutritive essenziali, minerali e vitamine. Alcune indicazioni sulla composizione delle alghe i media e la preparazione sono riportati in appendice. La densità cellulare iniziale è suggerito per essere circa 10 5 cellule / ml. La coltura di alghe è mantenuto in unotermostato ambiente a 20 (± 1) ° C, illuminato con lampade fluorescenti 3000 (± 300) lx, con un rapporto fotoperiodo di 16 ore di luce a 8 ore di oscurità.
Altre specie fitoplanctoniche potrebbe anche essere utilizzato per l'alimentazione ma sarebbe necessario effettuare studi comparativi con queste specie fitoplanctoniche per trovare i "equivalente" specie di Dunaliella tertiolecta, poiché le condizioni sperimentali (ad esempio densità cellulari iniziali, illuminazione luce, temperatura, composizione di terreni di coltura e tempo di esposizione) varia a seconda delle specie di fitoplancton. Oltre la tolleranza delle microalghe di inquinanti differenti deve essere considerata in quanto gli effetti inquinanti sulla crescita e lo sviluppo di impatto fitoplancton anche al Artemia.
2,4 Sostanza di riferimento
La sostanza di riferimento in questo test è Dodecyl solfato di sodio.
2,5 di vetro per laboratorio
- Contenitori di prova di cui 100 ml bicchieri di vetro borosilicato (18 per eseguire test e 18 per il trasferimento di soluzioni).
- Un pallone (ad esempio, beuta da 500 ml) per preparare la soluzione standard.
- Sei palloni (ad esempio, 200 palloni da ml) per preparare le soluzioni di testing.
- Vetro o polistirolo 5 cm di diametro piastre Petri con sfoderabile da utilizzare per attivare le cisti e trasferimento Artemia dal piatto schiusa ai contenitori di prova.
- Pipette Pasteur di vetro (con le punte arrotondate alla fiamma) per trasferire il naupli.
- Cannule di vetro o Pasteur 3 ml pipette di plastica monouso (da tagliare) per il trasferimento di Artemia.
- Micropipette e pipette graduate per preparare le soluzioni di testing.
- Sei cilindri graduati (per esempio 50 cilindri ml) per il trasferimento di soluzioni di test dai palloni a Tegli prova contenitori.
3. Cisti di attivazione
3,1. Piastre Petri contenenti cisti + versare acqua
Per generare organismi di prova, 20 mg di cisti sono posti in una capsula Petri contenente 12 ml di acqua di diluizione 48 ore prima della prova.
3.2. L'incubazione nella luce e nel buio
Il piatto Petri viene mantenuta a 25 (± 2) ° C e ad una 4000 (± 1000) lux (lumen per metro quadrato) l'intensità della luce per un'ora.
3,3. Sostituzione del mezzo con il microscopio
Dopo 24 ore, le larve schiusa sono trasferiti in una piastra Petri nuovo riempita con acqua artificiale. Il trasferimento viene eseguita utilizzando il microscopio, cioè utilizzando una sorgente luminosa in modo che l', larve cova fototropico migrano verso il fascio di luce. Un bicchiere pipetta Pasteur è usato per fare il trasferimento, assicurando che solo il nascente larve are trasferito e non le cisti o le larve ancora in membrane.
3,4. L'incubazione al buio
Il piatto contenente le larve è posto in una camera termostatica buio per 24 ore a 25 (± 2) ° C.
4. Preparazione delle soluzioni di prova
4,1. Pesatura della sostanza + trasferire nel pallone
Si raccomanda che la soluzione standard per la sostanza di prova viene preparata sciogliendo 0,5 g della sostanza in un pallone da 500 ml. Il pallone viene riempito con acqua deionizzata o distillata e la soluzione viene agitata fino a quando la sostanza di prova è completamente sciolto. Soluzioni devono essere preparate al momento dell'uso a meno che non è noto se la sostanza è stabile in soluzione. In tal caso, la soluzione standard può essere preparata fino a due giorni prima del test.
4,2. Preparazione del controllo negativo, l'aggiunta di acqua di diluizione e alghe wisecolo la pipetta da 10 ml
Il controllo negativo viene preparata in un pallone (esempio 200 ml) aggiungendo una aliquota della sospensione algale per l'acqua di diluizione in modo che una densità di 10 5 cellule / ml viene ottenuta.
4,3. Preparare le soluzioni di test: l'aggiunta di acqua di diluizione, alghe e soluzione standard
Si suggerisce che le soluzioni di prova sono preparati in cinque matracci tarati da 200 aggiungendo la soluzione standard per l'acqua di diluizione nelle quantità specificate in modo che le concentrazioni desiderate per il test si ottiene. Per alimentare gli organismi, aliquote di una sospensione Dunaliella microalghe tertiolecta possono essere utilizzati e aggiunto a raggiungere una densità di 10 5 cellule / ml quando soluzioni di prova sono preparati. Il seguente ordine di aggiunta è consigliato: acqua di diluizione, la sospensione delle alghe e la soluzione standard. Dopo la preparazione di soluzioni di test, essi devono essere utilizzati nel test appena possibile.
4,4. Trasferimento di soluzioni dal pallone ai contenitori di prova, poi le piastre di Petri
Quantità uguale (50 ml) delle soluzioni di prova sono introdotti nei contenitori di test che utilizza il cilindro graduato. Tre repliche per ciascuna concentrazione sono fatti. Per ciascuna serie di test, un contenitore di controllo viene preparato con una quantità di acqua di diluizione pari al volume delle soluzioni di prova. Volumi uguali (circa 12 ml) delle soluzioni di prova vengono introdotti nelle piastre di Petri. Per ogni serie di test, un piatto di controllo Petri viene utilizzato.
5. Preparazione per le prove
5,1. Nauplii al II-III stadio
Quarantotto ore dopo l'attivazione cisti, i naupli raggiungere il II-III stadio larvale e sono quindi utilizzabili per i test.
5,2. Trasferimento nauplii nelle piastre di Petri con il microscopio
Il piatto Petri utilizzato per cisti attivazione è preso dalla camera termostatica. Una piccola quantità di larve vengono trasferite in piastre di Petri contenenti il controllo e le soluzioni di test. Questo compito deve essere eseguito con il microscopio utilizzando una pipetta di diametro sufficientemente ampia in modo che i microrganismi non vengono danneggiati. In questa fase del test, il trasferimento può essere eseguito con una pipetta Pasteur vetro (con punta arrotondata di fiamma) e una sorgente di luce posizionati lateralmente che incoraggia il Artemia ad aggregarsi.
5,3. Trasferimento nauplii dalle piastre di Petri nei contenitori di prova con il microscopio
Dieci larve vengono trasferiti dalle soluzioni di prova Petri per i contenitori di prova. Anche questa operazione deve essere effettuata utilizzando la pipetta Pasteur e microscopio. Si raccomanda che un volume non superiore a 1 mL viene trasferito nel passaggio di larve non influenzare il volume complessivo del sistema di test.
e_step "> 5.4. contenitori pieni coperto con parafilmI bicchieri di prova sono coperti con parafilm (lasciando uno spazio per il passaggio dell'aria), e mantenuta ad una temperatura di 25 (± 2) ° C per tutta la durata della prova e ad una illuminazione di 900 (± 100) lx con un fotoperiodo rapporto di 14 ore di luce a 10 ore di oscurità.
6. Sostituzione del Supplemento Media and Food
6,1. Tasso di sopravvivenza di controllo
Due giorni dopo il test è stato avviato, e poi, dopo giorni 5, 7, 9 e 12, l'Artemia è osservato al microscopio per verificare il tasso di sopravvivenza e di sostituire il mezzo e l'integratore alimentare.
Numero di organismi viventi viene contato in ogni contenitore test. Dopo l'osservazione al microscopio e lieve stimolazione meccanica (ad esempio toccando le larve con una pipetta Pasteur di vetro), organismi che non mostrano un certo movimento per circa 10 seconds dovrebbe essere considerato morto.
6,2. Preparazione di una soluzione di prova mostra campionamento alghe con una pipetta 10 ml e campionamento della sostanza da testare con una micropipetta. Trasferimento di soluzioni dal pallone ai contenitori di test
Durante il test, le soluzioni di prova devono essere sostituiti periodicamente, e preparata nello stesso giorno in cui devono essere utilizzati. Le soluzioni di prova sono realizzati dalla soluzione standard precedentemente preparata.
6,3. Artemia trasferimento, utilizzando un taglio pipetta Pasteur, dai contenitori di prova vecchi ai tre nuovi contenitori
Il trasferimento di Artemia viene eseguito usando una pipetta con un diametro sufficientemente ampio in modo da non danneggiare gli organismi. Durante questa fase, uno ml 3 plastica pipetta Pasteur (da tagliare) possono essere utilizzati.
6,4. Le larve in un bicchiere contenente sia vivo o morto Artemia
Dopo 1 4 giorni di esposizione alla fine del test, il numero di sopravvissuti larve viene contato e registrato sul foglio. LC 50 e / o LC 20, NOEC e LOEC a 14 giorni, sono calcolati e registrati, così come i limiti di confidenza al 95% in cui i metodi appropriati, e di calcolo.
7. Risultati rappresentativi
Alla fine della prova (14 giorni), calcolare la percentuale di mortalità per ciascuna concentrazione, secondo la formula seguente:
(M s / N) * 100
Dove:
M s è il numero medio di individui morti nel campione analizzato
N è il numero totale di individui esposti
La tabella 1 riporta un esempio di dati di test (14d) con Artemia esposto sodio dodecil solfato.
| Concentrazioni (mg / l) | "> Numero di persone sono morte in ogni replicaMortalità (%) | |||
| Io | II | III | ||
| Controllo negativo | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1,56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3,12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6,25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12,5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
Inoltre, determinareLC 50 valore di una trama grafica gaussiana logaritmica o con metodi statistici appropriati (per esempio Spearman-Karber o di un metodo Probit). Il calcolo di LC 50 per i dati di tabella 1 è 8,18 (7,15-9,37) mg / l. Se la concentrazione massima causavano una mortalità inferiore del 50%, non si deve procedere al calcolo del valore 50 LC che sarebbe quindi inaffidabili o addirittura non calcolabile. In questo caso, tuttavia, sarebbe opportuno ripetere il test estendendo la gamma di concentrazioni testate. In alternativa, il valore LC 50 è più correttamente espressa come superiore alla concentrazione più elevata, che potrebbe indicare la percentuale di mortalità a concentrazione più elevata e la concentrazione massima corrispondente ad un nessun effetto.
I risultati sono considerate valide se alla fine del test le seguenti condizioni sono state soddisfatte:
- del controllo tasso di mortalità medioè ≤ 20%;
- dove con sodio dodecil solfato, il LC 50 a 14 giorni è incluso nel 8,0 (± 5) mg / l intervallo.
Se le condizioni di cui sopra non sono state rispettate, tutti i dati ottenuti con lo stesso lotto di organismi dovrebbero essere considerati non validi e prove ripetute.
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Discussion
Artemia è uno dei più importanti organismi di prova disponibili per i test di ecotossicità e di ricerca fatto finora ci consente di affermare che è possibile sostenere diverse opzioni connessi al consumo di Artemia in Tossicologia ed Ecotossicologia. Le caratteristiche che trasformano questo organismo in una specie adatti per saggi biologici sono: una vasta distribuzione geografica, elevata adattabilità a condizioni ambientali avverse e nutrienti vari, la cultura di laboratorio relativamente semplice e la manutenzione, resistenza alla manipolazione e di breve ciclo di vita, produzione figli grandi e le esistenza di una notevole quantità di informazioni su alcune specie. Una critica contro l'uso di Artemia è fatto riferimento alla sua sensibilità alle esposizioni chimiche: studi precedenti si riferiscono Artemia (test a 24 ore di esposizione) come specie meno sensibili per studi di ecotossicità, rispetto ad altri organismi di prova nelle stesse condizioni sperimentali 3. La scelta deimetodo di test di ecotossicità è fondamentale a questo riguardo. Volevamo standardizzare un metodo che ha le stesse condizioni iniziali (nauplii come organismo di prova, ottenuti con l'uso di cisti) del protocollo di 24 ore di esposizione 4, ma con tempi di esposizione relativamente lungo (14 giorni) potrebbe fornire una più risposta sensibile. Questo protocollo permette certamente una risposta più sensibile rispetto ai test di tossicità acuta ma non può essere utilizzato come sostituto per un test cronico causa una esposizione di 14 giorni non è rilevante se si considera la stima della durata Artemia. La selezione endpoint per questo metodo è stato ampiamente discusso. Inizialmente sia la mortalità e la crescita (lunghezza del carapace cioè dopo 14 giorni di esposizione) sono stati selezionati, perché abbiamo anche voluto garantire l'osservazione di un effetto subletale per un test a lungo termine. Tuttavia, l'endpoint subletali è risultato meno sensibile rispetto alla mortalità 6. Per questo motivo la mortalità è il traguardo indicato solo nel descriptione del protocollo e nel video. Questo risultato è coerente con gli studi di altri ricercatori 7,8 che hanno osservato che la sopravvivenza è il traguardo più sensibile tra quelli considerati da loro (sopravvivenza, la crescita e la riproduzione).
Il metodo proposto è utile per valutare la tossicità di prodotti chimici, effluenti e matrici ambientali 9. Nella caratteristica potrebbe essere interessante sottoporre a test altri effetti cronici sub-letali tossici, come biomarcatori (cioè attività enzimatica) 10.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Prodotto da Loredana Manfra dell'Istituto per la tutela dell'ambiente e della ricerca (ISPRA-Dipartimento di controllo della qualità ambientale) e Federica Savorelli dell'Agenzia Regionale per la Protezione dell'Ambiente (Emilia-Romagna, Italia).
I membri di riferimento per il sub-gruppo di lavoro il crostaceo Artemia all'interno del gruppo biologico Metodi - Saltwater / acque salmastre e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità delle acque (l'istituto per il funzionamento delle norme tecniche nel settore chimico).
Videografia e l'editing di Marco Pisapia di ISPRA (Unità Web).
Coordinamento della produzione di Anna Maria Cicero e Erika Magaletti di ISPRA (Dipartimento di controllo della qualità ambientale).
Vorremmo ringraziare l'Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale della Regione Emilia-Romagna, Filiale di Ferrara, il Gruppo biologica Metodi - Saltwater / SalmastroAcqua e sedimenti della Commissione UNICHIM sulla qualità dell'acqua e Luciana Migliore, Università di Tor Vergata (Roma) per la loro cooperazione; Rossella Boscolo e Massimo Gabellini di ISPRA (Dipartimento di Prevenzione e mitigazione degli impatti) per il loro sostegno finanziario, Fabio Matassa e il London Scuola di Lingue a Roma per il loro supporto linguistico.
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