Summary
本研究では、化学物質、産業廃水や下水と海水甲殻類の液体環境試料によって発揮される長期的（14日）致死毒性を決定するための貴重な方法論的なプロトコルの開発と標準化にかかわる
Abstract
我々の研究活動は、海水/汽水と堆積物への特定を参照して、環境の質の評価のための生物学的方法の使用を対象としています。生物学的指標の選択は、標準化された手順の可用性に、おそらく、信頼できる科学的知見に基づいてしなければなりません。本稿では、化学物質、および/ または海洋環境の行列の毒性を評価するために、海洋甲殻類のブラインシュリンプを使用した標準化されたプロトコルを提示します。科学者たちは、ブラインシュリンプ（ アルテミア ） は世界的に利用するための標準アッセイの開発に適した候補であることを提案する。論文の数は、ブラインシュリンプ（ アルテミア ）の様々な化学物質や有害物質の毒性に公開されています。毒性研究のためのこの甲殻類の主な利点は、乾燥した嚢胞の全体的な可用性であり、これらはすぐにテストで使用することができ、困難な栽培が求められていません
Protocol
1。メソッドは、標準
我々のテストは、14日間暴露し、定義された条件を満たす生物の50％（LC 50）の死を引き起こす濃度または希釈濃度を決定する目的のために物質濃度や試験サンプルの間隔にアルテミア幼生を公開することが含まれこの方法による。必要かつ可能であれば、以下も決定することができる。）露出した生物の20％（LC 20）の死を引き起こす濃度レベルと、b）のそれよりも高い死亡率を決定するものではありません最高の分析濃度レベルネガティブコントロール（NOEC）、14日後に、決定する最低試験濃度レベル、ネガティブコントロール（LOEC）のそれよりも高い死亡率。
2。材料試験
2.1 アルテミアの卵
テストを実行するには、 アルテミアfranciscana 5から得られた、ステージIIまたはIIIで、要求されます。テストをサポートするために利用認定卵や嚢胞は品質保証研究部門、米国環境保護庁、シンシナティOH 45268、米国や水生汚染の生物学的研究のための研究所から、ゲント大学、ベルギー、例えば、市販されている。
2.2水の希釈
合成塩水が認識され、分析品質の試薬または蒸留水または脱イオン水に市販の製剤を溶解して調製し、希釈水として使用することができます。理想的な海水を作成するための塩のブレンドは、 インスタントオーシャン混合物を 、例えば、市販されている。それは35（±2）に等しい塩分希釈水をお勧めしますPSUと同様に彩度の値の80％以上の溶存酸素濃度と温度25（±2）＆度、C. 48時間、少なくとも0.45μmの多孔度を有するフィルターでろ過するための曝気した後、希釈は0〜4℃の温度で、暗所で、最大30日間保存することができる
2.3藻類の培養
2.0x10 6細胞/ mlに-それは、試験生物は、指数関数的に成長し、1.3×10 6の密度に達するDunaliella tertiolecta微細藻類を餌であることをお勧めします。環境サンプルのテストは、2.0x10 6細胞/ mlの6より高い密度の文化を必要とします。それは（30（±2）PSU、20（±1）℃）Dunaliella tertiolectaは、海水を含む培養培地中で成長することが示唆された必須栄養素、ミネラル、ビタミンを加えた。藻類の培地組成と準備に関するいくつかの兆候は、付録に報告されています。初期細胞密度は約10 5細胞/ mlであることが示唆されています。藻類の培養は、内に保持され20部屋のサーモスタット（±1）℃、蛍光灯3000（±300）LX、闇の8時間に光の16時間の光周期比で照らさ。
他の植物プランクトン種が、また給紙を使用することができるが、それはDunaliella tertiolectaに"同等"の種を見つけるために、これらの植物プランクトン種との比較研究を行うことが必要となるため、実験条件（例えば、初期細胞密度、光照射、温度、組成物培地と露光時間）は、植物プランクトンの種によって異なります。別の汚染物質への耐性微細藻類のほかにも、 アルテミアへの植物プランクトンへの影響の成長と発展に汚染物質の影響するため考慮する必要があります。
2.4参照物質
このテストでは、参照物質は、ドデシル硫酸ナトリウムです。
2.5実験室ガラス製品
- 100ミリリットルホウケイ酸ガラスビーカー（18ソリューションを転送するためのテストと18を実行する）を含むテストコンテナ。
- 標準溶液を調製するためのフラスコ（500 mlフラスコ）。
- 試験溶液を調製するための6つのフラスコ（例えば、200 mlのフラスコ）。
- 嚢胞を活性化し、孵化皿からテストコンテナにアルテミアを転送するために使用される取り外し可能なカバー付きガラスやポリスチレン5cmの直径ペトリ皿。
- ノープリウスを転送するためのガラスパスツールピペット（炎で丸めヒント付き）。
- ガラスカニューレまたはアルテミアを転送するためのパスツールピペット3ミリリットル使い捨てのプラスチックピペット（カットする）。
- 試験溶液を調製するためにマイクロピペットとメスピペット。
- フラスコからtにテストソリューションを転送するための6つのメスシリンダー（例えば、50mlのシリンダ）彼はコンテナをテストする。
3。嚢胞のアクティベーション
3.1。嚢胞+注ぐ水を含むペトリ皿
試験生物を生成するには、嚢胞の20 mgを48時間テストの前に希釈水12ミリリットルを含むペトリ皿に置かれます。
3.2。光の中で、暗所でインキュベーション
ペトリ皿は、一時間のために25（±2）℃、4000（±1000）ルクス（平方メートルあたりのルーメン）の光強度で維持されます。
3.3。顕微鏡を用いて培地を交換する
24時間後、孵化幼虫は人工的な水で満たされた新しいペトリ皿に転送されます。転送が孵化、屈光性幼虫は、光ビームに向かって移動するように、すなわち光源を使用して、顕微鏡を使用して行われます。ガラスパスツールピペットは、その唯一の新生幼虫がARを確保するため、転送を行うために使用されますeが膜に残って嚢胞や幼虫を転送しません。
3.4。暗闇の中でインキュベーション
幼虫を含んだ料理は25℃で24時間、暗所恒温槽（±2）℃に置かれ
4。試験溶液の調製
4.1。物質+フラスコへの転送を量る
それは、テスト物質の標準溶液を500 mlのフラスコ中の物質0.5gを溶解して調製することをお勧めします。フラスコを脱イオン水または蒸留水を充填されており、試験物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌されています。ソリューションは、それは物質が溶液中で安定しているかどうかは知られていない限り、使用時に準備する必要があります。その場合には、標準溶液は、試験前に2日以内に調製することができる。
4.2。希釈水と藻wiを追加して、ネガティブコントロールの準備10ミリリットルピペット番目
ネガティブコントロールは、10 5細胞/ mlの密度が得られるように希釈水に藻類懸濁液の一部を追加することにより、フラスコ（例えば200ミリリットルの容積）で調製されています。
4.3。テストソリューションの準備：希釈水、藻類及び標準溶液を加える
それは、テストソリューションは、テストのための所望の濃度が得られるように指定した量の希釈水に標準溶液を添加することにより5 200ミリリットルのフラスコで調製されることをお勧めします。生物を養うために、Dunaliella tertiolecta微細藻類懸濁液のアリコートを、テスト·ソリューションが用意されて10 5細胞/ mlの密度に到達するために使用して追加することができます。また、次の順序が推奨されます。希釈水、藻類懸濁液および標準のソリューションを提供します。試験溶液の調製後、彼らはできるだけ早くアッセイに使用する必要があります。
4.4。フラスコからテストコンテナには、ペトリ皿に移すソリューション
テストソリューションの等量（50ml）をメスシリンダーを利用した試験容器に導入されています。各濃度の3つのレプリカが作られています。テストの各シリーズでは、コントロールコンテナは、テスト·ソリューションの体積に等しい希釈水の量で用意されています。試験溶液の等量（約12 ml）をペトリ皿に導入される。テストの各シリーズでは、コントロールのペトリ皿を使用しています。
5。テストの準備
5.1。 II-IIIの段階でノープリウス
嚢胞のアクティベーション48時間後、ノープリウスは、II-III幼虫の段階に到達してから、テストのために使用できます。
5.2。顕微鏡を用いてペトリ皿にノープリウス転送
嚢胞に使用されるペトリ皿活性化は、恒温槽から取り出しています。幼虫は少量の制御とテストソリューションを含むペトリ皿に転送されます。このタスクでは、生物が破損しないように十分に広い直径のピペットを利用した顕微鏡で実行されることになっている。テストのこのフェーズでは、転送がガラスパスツールピペット（炎で丸め先端）と集計するアルテミアを奨励して横方向に配置されたライトソースで実行されるかもしれません。
5.3。顕微鏡を使用してテストコンテナへのペトリ皿からノープリウス転送
十幼虫は、テストソリューションのペトリ皿からテストコンテナに転送されます。また、この操作は、パスツールピペットや顕微鏡を利用することによって実行する必要があります。それは1 mLを超えないボリュームは、テスト·システム全体の音量に影響を与えない幼虫の通過中に転送されることをお勧めします。
パラフィルムで覆われてe_step "> 5.4。フルコンテナテストのビーカーをパラフィルム（空気通路のギャップを残して）で覆われ、25℃の温度で維持されている（±2）℃試験の全期間、900の照明で（±100）日長とLX暗闇の10時間への光の14時間の比率。
6。ミディアムとフードサプリメントを交換する
6.1。生存率の制御
テストが開始された二日後、その5、7、9、12日後に、 アルテミアは、生存率を確認し、培地と栄養補助食品を置き換えるために顕微鏡下で観察されています。
生菌数は、各試験容器内にカウントされます。顕微鏡下で観察し、わずかに機械的刺激後（ガラスパスツールピペットで幼虫を触るなど）約10秒のためのいくつかの動きを表示しない生物econdsは死んだと見なされるべきである。
6.2。マイクロピペットを使用してテストする物質の10 mlのピペットとサンプリングと藻類のサンプリングを示す試験溶液の調製。フラスコからテストコンテナへの転送ソリューション
テスト中、テストソリューションは、定期的に交換し、それらが使用されるのと同じ日に準備する必要があります。試験溶液を予め調製した標準溶液から作られています。
つの新しいコンテナに古いテストコンテナから6.3。 アルテミア転送 、カットパスツールピペットを利用して、
アルテミアの転送は、そのような生物を傷つけないように十分に広い直径をピペットを用いて行われる。このフェーズでは、3ミリリットルプラスチック製パスツールピペットは（カットする）を使用することができます。
6.4。ライブまたは死んだアルテミアを含むビーカーの幼虫
1の後テストの終わりに露出の4日間は、幼虫の生存数をカウントし、ワークシートに記録されます。 14日目のLC 50および/ またはLC 20、NOECおよびLOECは、計算されたと記録されたほか、95％信頼限界を必要に応じて、計算方法をされています。
7。代表的な結果
テスト（14日）の終わりには、次の式に従って、各濃度での死亡率の割合を計算します。
（M、S / N）* 100
ここで、
M sは 、分析試料中に死亡した個体数の平均値です
Nは、曝露した人の総数です。
表1レポートドデシル硫酸ナトリウムにさらされたアルテミアとテスト（14D）のデータの例を。
| 濃度（mg / l）の | 各レプリカで死亡した個人の "> 数死亡率（％） | |||
| 私は | 2 | 3 | ||
| 負の制御 | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1.56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3.12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6.25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12.5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
また、決定するグラフィカルガウス対数プロットするか、適切な統計的手法（例えばスピアマン-Karberまたはプロビット法）を用いてLC 50値を返します。表1のデータのためのLC 50の計算は、8.18（7.15から9.37）mg / Lである。最大濃度は50％の低死亡率の原因となった試験を行った場合、あなたは、信頼できない、あるいは非計算になるLC 50値の計算に進むべきではありません。ただし、この場合、試験濃度の範囲を拡張することにより、テストを繰り返すことが適切であろう。また、LC 50値はより正確に最高濃度よりも大きいように表現されている可能性が試験した最高濃度と効果なしに対応した最高濃度で死亡率の割合を示す、テストされています。
以下の条件をテストの終了時に満たされている場合、結果は有効とみなされています。
- コントロールの平均死亡率≤20％です。
- ドデシル硫酸ナトリウムを使用して、どこに、14日間のLC 50は 8.0（±5）mg / lの区間に含まれています。
上記の条件が満たされていない場合、生物の同じバッチで得られたすべてのデータは無効と見なされ、テストは繰り返されるべきである。
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Discussion
アルテミアは、私たちは、それが毒性毒性学におけるアルテミアの使用に関連するいくつかのオプションを維持することが可能であることを明記することができ、これまで行わ生態毒性試験および研究のために利用できる最も貴重な試験生物の一つです。バイオアッセイに適した種にこの生物をオン特性は次のとおりです。広い地理的分布、不利な環境条件と様々な栄養素を、比較的単純な培養検査、メンテナンス、操作への抵抗、短いライフサイクル、大規模な子孫の生産と高い適応性いくつかの種については、かなりの量の存在。 アルテミアの使用に対する批判は、化学物質暴露に対する感度と呼ばれています。以前の研究では、3つの同一の実験条件下で他の試験生物と比較すると、生態毒性研究のための機密性の低い種とし てアルテミア （24時間の暴露試験）を参照してください。選択生態毒性試験方法は、この点で重要である。我々は、暴露4の24時間プロトコルの同じ開始条件（試験生物としてのノープリウス、嚢胞の使用から得られる）であった方法を標準化したかったのですが、比較的長い露出時間（14日）でより多くを提供することができます敏感な反応。このプロトコルは、確かに急性試験よりも敏感に反応することができますが、我々はアルテミアの推定寿命を考慮すれば14日間の曝露が関係ありませんので、それは慢性試験の代用として使用することはできません。このメソッドのエンドポイントの選択については広く議論されています。我々はまた、長期試験のために致死効果の観察を確実にしたかったので当初は死亡率と成長（14日間の暴露後すなわち甲羅の長さ）の両方が、選択された。しかし、致死エンドポイントは死亡率が6に比べてそれほど敏感であることが判明した。この理由のために死亡率はdescriptのに記載されているエンドポイントのみです。プロトコルとビデオのイオン。この知見は、その生存率はそれらの（生存、成長、生殖）で考えられるものの中で最も鋭敏なエンドポイントで観察され、他の研究者の研究7,8と一貫性があります。
提案手法は、化学物質、排水や環境の行列9の毒性を評価するのに便利です。機能では、このようなバイオマーカー（すなわち、酵素活性10）などの他のサブ致死慢性毒性効果をテストすることも面白いかもしれません。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
環境保護や研究のための研究所のLoredana Manfra（環境品質監視のイスプラ·専攻）と環境保護のための地域機関（エミリアロマーニャ、イタリア）のフェデリカSavorelliによって生成された。
生物学的方法グループ内のアルテミア甲殻類のサブワーキンググループのリファレンスメンバー-水の品質に及ぼす塩水/ UNICHIM委員会の汽水と土砂（化学部門の技術標準オペレーティング·システム用の研究所）。
イスプラのマルコPisapia（Webユニット）によるビデオ撮影と編集。
アンナ·マリア·キケロとイスプラのエリカMagaletti（環境品質監視科）による生産調整。
海水/汽水 - 私たちは、エミリアロマーニャの環境保護、フェラーラ支店、生物学的方法グループの地域の代理店に感謝したいと思いますロセラボスコロとその財政支援のためのイスプラのマッシモGabellini（予防と影響の緩和科）;ファビオMatassaとロンドンの水質とルチアナミリオレ、彼らの協力のためのイビストルヴェルガータ大学（ローマ）のUNICHIM委員会の水と土砂彼らの言語サポートのためにローマの言語の学校。
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