Langsiktig Dødelig toksisitet Test med krepsdyret Artemia franciscana Published: April 14, 2012 doi: 10.3791/3790

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Loredana Manfra¹, Federica Savorelli², Marco Pisapia¹, Erika Magaletti¹, Anna Maria Cicero¹

¹Department of Environmental Quality Monitoring, Institute for Environmental Protection and Research, ²Regional Agency for Environmental Protection in Emilia-Romagna

Summary

Denne studien handler om utvikling og standardisering av en verdifull metodisk protokoll for å bestemme langsiktige (14 dager) dødelig toksisitet utøves av kjemiske stoffer, industrielt avløpsvann eller kloakk og flytende miljøprøver på saltvann krepsdyr,

Abstract

Våre forskningsaktiviteter målrette bruk av biologiske metoder for evaluering av miljøkvalitet, med særlig henvisning til saltvann / brakkvann og sediment. Valget av biologiske indikatorer må baseres på pålitelig vitenskapelig kunnskap, og muligens, på tilgjengeligheten av standardiserte prosedyrer. I denne artikkelen presenterer vi en standardisert protokoll som brukes det marine krepsdyret Artemia å vurdere toksisitet av kjemikalier og / eller marine miljø matriser. Forskere foreslår at saltlake reker (Artemia) er en egnet kandidat for utvikling av en standard bioassay for globalt utnyttelse. En rekke artikler har blitt publisert på de toksiske effektene av ulike kjemikalier og miljøgifter på saltlake reker (Artemia). Den store fordelen med dette krepsdyret for toksisitetsstudier er den generelle tilgjengeligheten av de tørre cyster, disse kan umiddelbart brukes i testing og vanskelig kultivering er ikke etterspurt 3. Den foreslåtte metoden innebærer dødelighet som et endepunkt. Tallene for overlevende ble talt opp og andelen dødsfall ble beregnet. Larvene ble ansett døde hvis de ikke viser noen intern eller ekstern bevegelse i flere sekunder av observasjon ^4. Denne prosedyren var standardiserte tester en referanse stoff (Sodium Dodecyl Sulfate), og noen resultater er rapportert i dette arbeidet. Denne artikkelen følger en video som beskriver utførelsen av prosessuelle toksisitetstesting, viser alle trinnene knyttet til protokollen.

Protocol

1. Metode Standard

Vår testing innebærer å utsette Artemia larver til et intervall på stoff konsentrasjoner eller en stikkprøve for å bestemme konsentrasjonen eller fortynning nivåer som ville føre til døden av 50% av organismene (LC ₅₀₎ eksponert over 14 dager og møte vilkårene definert av denne metoden. Hvis det er nødvendig og mulig, kan følgende også bestemmes: a) konsentrasjonen nivå som forårsaker død på 20% av organismer som eksponeres (LC _20), b) det høyeste analysert konsentrasjon nivå som avgjør ikke en høyere dødelighet enn den negative kontrollen (NOEC), den laveste testede konsentrasjonen nivå som avgjør, etter 14 dager, en høyere dødelighet enn den negative kontrollen (LOEC).

2. Testing Materials

2.1 Artemia egg

For å utføre testing, Artemia franciscana 5. Sertifiserte egg eller cyster benyttes til å støtte testing er kommersielt tilgjengelig, for eksempel fra Quality Assurance Research Division, US Environmental Protection Agency, Cincinnati 45268 OH, USA eller fra Laboratorium for biologisk forskning i Aquatic Pollution, Universitetet i Gent, Belgia.

2.2 Vann fortynning

Syntetisk saltvann kan brukes som fortynning vann, utarbeidet ved oppløsning av anerkjente analytiske kvalitet reagenser eller en kommersielt tilgjengelig formulering i destillert eller de-ionisert vann. Salt blandinger for å lage den ideelle saltvann er kommersielt tilgjengelig, for eksempel de Instant Ocean blandinger. Det anbefales en fortynning vann med en saltholdighet lik 35 (± 2) PSU samt en oppløst oksygen konsentrasjon av mer enn 80% av verdien av metning og en temperatur på 25 (± 2) oggrader; C. Etter lufting i 48 timer og filtrering i filtre med en porøsitet på minst 0,45 mikrometer, kan fortynning lagres i maksimalt 30 dager i mørke ved en temperatur på 0-4 ° C.

2,3 alge kultur

Det anbefales at testorganismene er fôret på Dunaliella tertiolecta mikroalger, som vokser eksponentielt, og nå tettheter av 1.3x10 ⁶ - 2.0x10 ⁶ celler / ml. Testing på miljøprøver krever kulturer med tettheter høyere enn 2.0x10 ⁶ celler / ml ^6. Det er foreslått at Dunaliella tertiolecta vokser i en kultur medier som inneholder sjøvann (30 (± 2) PSU og 20 (± 1) ° C) med tillegg av essensielle næringsstoffer, mineraler og vitaminer. Noen indikasjoner på alger media sammensetning og forberedelse er rapportert i vedlegg. Den første celle tetthet er foreslått å være ca 10 ⁵ celler / ml. Den alger kulturen opprettholdes i enromtermostat ved 20 (± 1) ° C, opplyst med lysrør 3000 (± 300) LX, med en daglengde forholdet 16 timer med lys til 8 timer mørke.

Andre planteplankton arter kan også brukes til fôring, men det ville være nødvendig å gjøre komparative studier med disse planteplankton artene å finne de "tilsvarende" arter til Dunaliella tertiolecta, fordi de eksperimentelle forhold (for eksempel første celle tettheter, lys belysning, temperatur, sammensetning av kultur media og eksponeringstid) varierer mellom planteplankton arter. I tillegg til toleranse av mikroalger til ulike forurensende stoffer må vurderes fordi forurensende effekter på vekst og utvikling av planteplankton innvirkning også på Artemia.

2.4 Referanse stoff

Henvisningen stoffet i denne testen er Sodium Dodecyl Sulfate.

2,5 laboratorieglass

1. Testing beholdere inkludert 100 ml borsilikatglass begerglass (18 til å utføre testing og 18 for å overføre løsninger).
2. En kolbe (f.eks 500 ml kolbe) å forberede standard løsning.
3. Seks flasker (f.eks 200 ml flasker) for å forberede de testing løsninger.
4. Glass eller isopor 5 cm diameter petriskåler med avtagbare trekk som skal brukes for å aktivere cyster og overføre Artemia fra klekking fatet til testing beholdere.
5. Glass Pasteurs pipetter (med tips runde med flamme) for overføring av nauplier.
6. Glass kanyler eller Pasteur 3 ml disponibel plast pipetter (kuttes) for overføring av Artemia.
7. Mikropipetter og ble uteksaminert pipetter å forberede testing løsninger.
8. Seks uteksaminerte sylindere (f.eks 50 ml sylindere) for overføring av testing løsninger fra flaskene til than teste beholdere.

3. Cyste Aktivisering

3.1. Petriskåler som inneholder cyster + helle vann

For å generere testorganismene, er 20 mg av cyster plasseres i en petriskål inneholder 12 ml fortynningsvann 48 timer før testing.

3.2. Inkubasjon i lyset og i mørket

Den petriskål er opprettholdt på 25 (± 2) ° C og ved en 4000 (± 1000) lux (lumen per kvadratmeter) lysintensiteten i én time.

3.3. Skifte medium ved hjelp av mikroskop

Etter 24 timer, blir det klekking larvene overført til en ny petriskål fylt med kunstig vann. Overføringen er utført ved hjelp av mikroskop, dvs. ved hjelp av en lyskilde slik at klekkingen, phototropic larver migrerer mot lysstrålen. Et glass Pasteur pipette brukes til å gjøre overføringen, slik at kun den gryende larvene are overført og ikke cyster eller larver fortsatt i membraner.

3.4. Inkubasjon i mørket

Retten inneholder larvene er plassert i en mørk termostatisk kammer i 24 timer ved 25 (± 2) ° C.

4. Utarbeidelse av testing løsninger

4.1. Veiing stoffet + overføring til kolben

Det anbefales at standard løsning for testing stoffet er utarbeidet ved å løse opp 0,5 g av stoffet i en 500 ml flaske. Kolben er fylt opp med de-ionisert eller destillert vann, og løsningen blir rørt til testing stoffet er helt oppløst. Løsninger må være forberedt på det tidspunktet bruk med mindre det ikke er kjent om stoffet er stabilt i løsning. I så fall kan standardløsningen være forberedt inntil to dager før testing.

4.2. Klargjøre den negative kontrollen, legger fortynningsvann og alger with 10 ML pipetten

Den negative kontrollen er utarbeidet i en kolbe (f.eks 200 ml volum) ved å legge til en delmengde av alger suspensjonen til fortynningsvann slik at en tetthet på 10 ⁵ celler / ml oppnås.

4.3. Forberede testing løsninger: legge fortynningsvann, alger og standard løsning

Det foreslås at testing løsninger er utarbeidet i fem 200 ml flasker ved å legge til standard løsning til fortynningsvann i mengdene som er angitt slik at de ønskede konsentrasjoner for testing oppnås. Å mate organismer, kan alikvoter av en Dunaliella tertiolecta mikroalger suspensjon brukes og legges til nå en tetthet på 10 ⁵ celler / ml når testing løsninger er forberedt. Følgende rekkefølge tillegg anbefales: fortynningsvann, alger fjæring og standard løsning. Etter utarbeidelse av testing løsninger, må de brukes i analysen så snart som mulig.

4.4. Overføre løsninger fra Kolben til testing containere, deretter til petriskåler

Like mengder (50 ml) av testing løsninger blir introdusert i testing beholdere utnytte uteksaminert sylinder. Tre kopier for hver konsentrasjon er gjort. For hver serie med tester, er en kontroll container forberedt med en mengde fortynningsvann lik volumet på test løsninger. Like volumer (ca. 12 ml) i test løsninger innføres i petriskåler. For hver serie med tester, er en kontroll petriskål brukt.

5. Forberedelse til Testing

5.1. Nauplier ved II-III scenen

Førtiåtte timer etter cyste aktivering, det nauplier nå II-III larvestadiet og er så brukbare for testing.

5.2. Nauplier overføringen inn i petriskåler hjelp av mikroskop

Den petriskål brukt for cyste aktivering er tatt ut av termostat kammeret. En liten mengde larver blir overført til petriskåler som inneholder kontrollen og testing løsninger. Denne oppgaven skal utføres med mikroskop benytte en pipette av tilstrekkelig stor diameter slik at organismene ikke blir skadet. I denne fasen av testen, kan overføringen utføres med et glass Pasteur pipette (med spissen avrundet med flamme) og et lateralt plassert lyskilde som oppfordrer Artemia å aggregere.

5.3. Nauplier overføring fra petriskåler i test beholdere med mikroskopet

Ti Larvene blir overført fra testing løsninger petriskåler til testing beholdere. Også denne operasjonen må utføres ved å utnytte Pasteur pipette og mikroskop. Det anbefales at et volum som ikke overstiger 1 ml overføres under passering av larvene ikke påvirker den totale volumet av testsystemet.

e_step "> 5.4. Full containere dekket med Parafilm

De testing begre er dekket med Parafilm (etterlater et gap for luft passasje), og opprettholdt ved en temperatur på 25 (± 2) ° C for hele varigheten av testen og på en belysning av 900 (± 100) LX med en daglengde forholdet 14 timer lys 10 timer mørke.

6. Skifte Medium og Kosttilskudd

6.1. Overlevelsesraten kontroll

To dager etter at testen har startet, og deretter etter 5, 7, 9 og 12 dager, er Artemia observeres under mikroskop for å verifisere overlevelse og for å erstatte mediet og kosttilskudd.

Antall levende organismer regnes i hver test container. Etter observasjon under mikroskopet og svak mekanisk stimulering (f.eks berøre larvene med et glass Pasteur pipette) organismer som ikke viser noen bevegelse i ca 10 seconds bør vurderes død.

6.2. Utarbeidelse av en test løsning som viser alger prøvetaking med en 10 ml pipette og prøvetaking av stoffet som skal testes med en mikropipette. Overføre løsninger fra Kolben til test containere

Mens testing, må test løsninger regelmessig skiftes, og tilberedes på samme dag som de skal brukes. Test løsninger er laget av standard løsning tidligere forberedt.

6.3. Artemia overføring, utnytte et kutt Pasteur pipette, fra de gamle test containere til de tre nye containere

Overføringen av Artemia er utført ved hjelp av en pipette med en tilstrekkelig stor diameter for ikke å skade organismer. I denne fasen kan en 3 ml plast Pasteur pipette (til å klippe) brukes.

6.4. Larver i et begerglass som inneholder enten levende eller døde Artemia

Etter 1 4 dager med eksponering på slutten av testing, er antallet overlevende larver telles og registreres i regnearket. LC ₅₀ og / eller LC _20, blir NOEC og LOEC på 14 dager, beregnet og registrert, samt konfidensintervall på 95% der dette er hensiktsmessig, og beregningsmetoder.

7. Representative Resultater

På slutten av testen (14 dager), beregne prosentandelen av dødelighet ved hver konsentrasjon, i henhold til følgende formel:

(M _S / N) * 100

Hvor:

M _s er gjennomsnittlig antall døde individer i prøven analysert

N er totalt antall eksponerte individer

Tabell 1 rapporter et eksempel på data fra en test (14d) med Artemia utsettes for Sodium Dodecyl Sulfate.

"> Antall døde personer i hver kopi

Konsentrasjoner (mg / l)	Dødelighet (%)
	Jeg	II	III
Negativ kontroll	0	2	1	10
1,56	1	2	0	10
3,12	2	0	2	13
6,25	3	2	3	27
12,5	8	9	10	90
25,0	10	10	10	100
50,0	10	10	10	100

Videre bestemmeLC _50-verdi ved en grafisk Gaussian logaritmisk plott eller ved hjelp av egnede statistiske metoder (for eksempel Spearman-Karber eller Probit Method). Beregningen av LC ₅₀ for dataene i tabell 1 er 8,18 (7,15 til 9,37) mg / l. Dersom den maksimale konsentrasjonen testet forårsaket en lavere dødelighet på 50%, bør du ikke fortsette til beregning av LC _50-verdi som da ville være upålitelig eller til og med ikke-Computable. I dette tilfellet, derimot, ville være hensiktsmessig å gjenta testen ved å utvide omfanget av konsentrasjoner som er testet. Alternativt har LC ₅₀ verdien mer korrekt uttrykt som større enn den høyeste konsentrasjonen testet, muligens indikerer prosentandelen av dødelighet ved høyeste konsentrasjon testet og den høyeste konsentrasjonen som tilsvarer en ingen effekt.

Resultatene er vurdert gyldig hvis på slutten av testing følgende vilkår er oppfylt:

1. kontrollens gjennomsnittlig dødeligheter ≤ 20%;
2. der bruk Sodium Dodecyl Sulfate, LC ₅₀ på 14 dager er inkludert i 8.0 (± 5) mg / l intervall.

Hvis de ovennevnte vilkår ikke er oppfylt, bør alle data innhentet med samme batch av organismer anses som ugyldig og testing gjentas.

Discussion

Artemia er en av de mest verdifulle testorganismene tilgjengelige for økotoksisitet testing og forskning gjort så langt kan vi slå fast at det er mulig å opprettholde flere alternativer knyttet til Artemia bruk i toksikologi og økotoksikologi. Kjennetegnene som slår denne organismen i en egnet art for bioassay er: en bred geografisk fordeling, høy tilpasningsevne til ugunstige miljøforhold og varierte næringsstoffer, relativt enkelt laboratorium kultur og vedlikehold, motstand mot manipulasjon, kort livssyklus, stor avkom produksjon og eksistensen av en betydelig mengde informasjon om enkelte arter. En kritikk mot bruk av Artemia er referert til sin følsomhet for kjemiske eksponeringer: tidligere studier viser Artemia (test til 24 timers eksponering) som en mindre sensitiv art for Økotoksikologiske studier, sammenlignet med andre testorganismene under de samme eksperimentelle forhold ^3. Valget avmetode for økotoksisitet testing er avgjørende i denne sammenheng. Vi ønsket å standardisere en metode som hadde de samme start vilkår (nauplier som en test organisme, hentet fra bruk av cyster) av protokollen til 24 timers eksponering ^4, men med relativt lange eksponeringstider (14 dager) kan gi en mer sensitiv respons. Denne protokollen tillater absolutt en mer sensitiv respons enn de akutte tester, men det kan ikke brukes som erstatning for en kronisk test fordi en eksponering på 14 dager er ikke aktuelt dersom vi anser anslaget levetid Artemia. Endepunktet utvalget for denne metoden har vært mye diskutert. Opprinnelig både dødelighet og vekst (dvs. skjoldlengde etter 14 dagers eksponering) ble valgt, fordi vi ønsket også å sikre observasjon av en sublethal effekt for en langsiktig test. Ble imidlertid sublethal endepunkt funnet å være mindre sensitive i forhold til dødelighet ^6. Av denne grunn dødelighet er den eneste endepunkt nevnt i description av protokollen, og i videoen. Dette funnet er konsistent med studier av andre forskere ^7,8 som observerte at overlevelse er det mest følsomme endepunktet blant de vurderes av dem (overlevelse, vekst og reproduksjon).

Den foreslåtte metoden er nyttig for å vurdere toksisitet av kjemikalier, utslipp og miljø matriser ^9. I funksjonen kan det være interessant å teste andre sub-dødelige kroniske toksiske effekter, for eksempel biomarkører (dvs. enzymatisk aktivitet) ^10.