Summary
Это исследование касается разработки и стандартизации ценный методологический протокол для определения долгосрочных (14 дней) летальный токсичность оказывают химические вещества, промышленных сточных вод или сточных вод и жидких проб окружающей среды на морских ракообразных,
Abstract
Наша исследовательская деятельность нацелены на использование биологических методов для оценки качества окружающей среды, с особым упором на морской / соленой воды и осадка. Выбор биологические показатели должны быть основаны на надежных научных знаний и, возможно, на наличие стандартных процедур. В этой статье мы представляем стандартизированный протокол, который используется морских ракообразных Artemia для оценки токсичности химических веществ и / или морской среды матриц. Ученые предлагают артемии (Artemia) является подходящим кандидатом для разработки стандартных биопроб во всем мире использование. В ряде работ были опубликованы на токсическое воздействие различных химических веществ и токсичных веществ на артемии (Artemia). Основное преимущество этого рачка для исследования токсичности общей доступности сухой кисты; они могут быть немедленно использованы в тестировании и трудно выращивание не требует
Protocol
1. Метод стандартных
Наше тестирование включает в себя разоблачение Артемия личинок интервале концентраций веществ или образца для определения концентрации или разведения уровней, которые могут вызвать гибель 50% организмов (LC 50) подвергается в течение 14 дней и удовлетворения условий, определенных с помощью этого метода. Если это необходимо и возможно, следующий может быть также определены: а) уровень концентрации, что вызывает гибель 20% организмов, подвергаются (LC 20), б) высокий уровень концентрации проанализировать, что не определяет высокий уровень смертности, чем у Отрицательный контроль (NOEC), самый низкий уровень концентрации проверенных который определяет, через 14 дней, более высокий уровень смертности, чем отрицательного контроля (LOEC).
2. Тестирование материалов
2,1 яйца артемии
Для выполнения тестирования, артемии franciscana 5. Сертифицированный яйца или кисты использовать для поддержки тестирования являются коммерчески доступными, например, от исследований качества Отдел охране окружающей среды США, Цинциннати OH 45268, США или из лаборатории биологических исследований в загрязнение водной среды, Университет Гента, Бельгия.
2.2 Вода разбавления
Синтетическая морская могут быть использованы как разбавление водой, готовят путем растворения признаны аналитические реагенты качества или коммерчески доступные композиции в дистиллированной или деионизированной водой. Соль смесей для создания идеальной морской коммерчески доступны, например, мгновенных смеси океана. Рекомендуется разбавление водой с минерализацией равной 35 (± 2) Блок питания, а также концентрации растворенного кислорода более 80% от стоимости насыщенности и температуре 25 (± 2) иград; C. После проветривания в течение 48 часов и фильтрации в фильтрах с пористостью не менее 0,45 мкм, разведение может быть сохранена в течение максимум 30 дней в темном месте при температуре 0-4 ° C.
2,3 цветения культуры
Рекомендуется, чтобы тест организмы питаются микроводоросли Dunaliella tertiolecta, которые растут в геометрической прогрессии и достигает плотности 1.3x10 6 - 2.0x10 6 клеток / мл. Тестирование на пробах окружающей среды требует культуры с плотностью выше 2.0x10 6 клеток / мл 6. Предполагается, что Dunaliella tertiolecta растет в среде, содержащей культуру морской воды (30 (± 2) Блок питания и 20 (± 1) ° С) с добавлением питательных веществ, минералов и витаминов. Некоторые указания на состав водорослей средств массовой информации и подготовки приведены в Приложении. Начальная плотность клеток предлагается составлять примерно 10 5 клеток / мл. Культуры водорослей ведется вкомнатный термостат при температуре 20 (± 1) ° C, освещенные люминесцентными лампами 3000 (± 300) лк, с отношением светового дня 16 часов света в 8 часов темноты.
Другие виды фитопланктона также может быть использован для питания, но нужно было бы сделать сравнительные исследования этих видов фитопланктона, чтобы найти "эквивалент" видов Dunaliella tertiolecta, потому что условия эксперимента (например, начальная плотность клетки, свет освещение, температура, состав медиакультуры и времени экспозиции) варьируется в зависимости от видов фитопланктона. Кроме того, толерантность микроводорослей различных загрязняющих веществ должен быть рассмотрен, так как загрязнителей на рост и развитие фитопланктона влияние также артемии.
2,4 Ссылка вещества
Эталонного вещества в этом тесте сульфат натрия додецилсульфата.
2,5 Лабораторная посуда
- Тестирование в том числе контейнеров 100 мл боросиликатного стекла стаканы (от 18 до проведения испытаний и 18 для передачи решений).
- Колба (например, 500 мл колбе) для подготовки стандартного решения.
- Шесть колб (например, 200 мл колбы) для подготовки тестирования решений.
- Стекла или полистирола диаметром 5 см чашки Петри с съемными крышками, которые будут использоваться для активации кисты и передачи Артемия от вылупления блюдо испытаний контейнеров.
- Стеклянные пипетки Пастера (с советами окруженной пламенем) для передачи науплии.
- Стекло канюли или Пастера 3 мл одноразовые пластиковые пипетки (быть сокращены) для передачи артемии.
- Микропипетки и градуированной пипетки для подготовки тестирования решений.
- Шесть цилиндров ступенчатая (например, 50 мл цилиндры) для передачи тестировании решений из колбы в тОн тестирования контейнеров.
3. Киста активации
3.1. Чашки Петри содержащих кисты + лить воду
Чтобы создать тест-организмов, 20 мг кист помещают в чашку Петри, содержащую 12 мл воды для разбавления 48 часов до тестирования.
3.2. Инкубация в свет и в темноте
Чашке Петри поддерживается при 25 (± 2) ° С и 4000 (± 1000), люкс (люмен на квадратный метр) интенсивность света на один час.
3.3. Замена среде с использованием микроскопа
После 24 часов, штриховки личинки переносят в новую чашку Петри заполнены с искусственным воды. Передача осуществляется с помощью микроскопа, т.е. с помощью источника света, так что вылупления фототропным личинки мигрируют в направлении светового луча. Стеклянные пипетки Пастера используется, чтобы сделать передачу, гарантируя, что только зарождающейся личинок арэлектронной передачи и не кисты или личинки до сих пор в мембранах.
3.4. Инкубация в темноте
Блюдо с личинками помещается в темное термостате в течение 24 часов при 25 (± 2) ° С.
4. Подготовка тестирования решений
4.1. Взвешивание вещества + трансфер в колбу
Рекомендуется стандартное решение для тестирования вещества готовят путем растворения 0,5 г вещества в 500 мл колбу. Колба заполнена деионизированной или дистиллированной воды и раствор перемешивают до испытаний вещество полностью не растворится. Решения должны быть подготовлены во время использования, если оно не известно, является ли вещество стабильным в растворе. В этом случае стандартный раствор можно приготовить до двух дней до тестирования.
4.2. Подготовка отрицательного контроля, добавив, разведения водой и водорослями шм 10 мл пипетки
Отрицательный контроль подготовлен в колбу (например, 200 мл объемом), добавляя аликвоту суспензии водорослей для разбавления водой так, чтобы плотность 10 5 клеток / мл получается.
4.3. Подготовка к тестированию решения: добавление разбавление водой, водорослями и стандартные решения
Предполагается, что тестирование решения готовят в пяти колб 200 мл путем добавления стандартных решений для разбавления водой в количествах, указанных таким образом, что желаемое концентрации для тестирования получается. Чтобы прокормить организмов, аликвоты микроводоросли Dunaliella tertiolecta подвески могут быть использованы и добавил, чтобы достичь плотности 10 5 клеток / мл при тестировании решения подготовлены. Следующий порядок того, рекомендуется: разбавление водой, водорослями подвеска и стандартные решения. После подготовки тестирования решения, они должны быть использованы в анализе как можно скорее.
4.4. Перенос решения из колбы для тестирования контейнеров, то в чашки Петри
Равное количество (50 мл) тестирование решения вводятся в тестировании контейнеров использования мерный цилиндр. Три реплики для каждой концентрации сделаны. Для каждой серии испытаний, контроля контейнеров подготовлен с количеством воды для разбавления равен объему теста решений. Равные объемы (около 12 мл) Тест решения вводятся в чашках Петри. Для каждой серии испытаний, контроля блюдо Петри используются.
5. Подготовка к тестированию
5.1. Nauplii на II-III стадии
Сорок восемь часов после активации кисты, науплии достигает II-III стадии личинки, а затем использовать для тестирования.
5.2. Nauplii передачи в чашках Петри с микроскопом
Чашку Петри для кисты активации берется из термостатической камере. Небольшое количество личинок переносят в чашки Петри, содержащие контроля и тестирования решений. Эта задача должна быть выполнена с использованием микроскопа пипетки достаточно большого диаметра, так что организм не получить повреждения. На этом этапе испытаний, передача может быть выполнена со стеклянной пипетки Пастера (с наконечником окруженной пламенем), а сбоку расположен источник света, что способствует артемии в совокупности.
5.3. Nauplii трансфер из чашки Петри в тесте контейнеров с микроскопом
Десять личинки переходят с блюдами тестирования решений Петри к испытаниям контейнеров. Кроме того, эта операция должна быть выполнена с использованием пипетки Пастера и микроскоп. Рекомендуется, чтобы объем не более 1 мл передается при прохождении личинок не влияет на общий объем тестовой системе.
e_step "> 5.4. Полные контейнеры покрыты парафильмомТестирование стаканы покрыты парафильмом (оставляя зазор для прохождения воздуха), и выдерживают при температуре 25 (± 2) ° С в течение всего периода испытаний и при освещенности 900 (± 100) лк с фотопериода Отношение 14 часов света 10 часов темноты.
6. Замена среднего и добавки к пище
6.1. Контроль Выживаемость
Через два дня после начала теста, а затем, после 5, 7, 9 и 12 дней, артемии наблюдается под микроскопом, чтобы проверить выживаемость и заменить среды и пищевых добавок.
Количество живых организмов считается в каждый тестовый контейнер. После наблюдения под микроскопом и небольшое механическое раздражение (например, касаясь личинок со стеклянной пипетки Пастера) организмов, которые не показывают некоторое движение в течение 10 сeconds следует считать мертвым.
6.2. Подготовка тест решение показывает водорослей выборки с 10 мл пипетки и отбора проб вещества, быть проверены с микропипетки. Перенос решения из колбы для тестов контейнеров
В то время как тестирование, тест решения должны периодически заменить, и готовы в тот же день, как они будут использоваться. Испытание решения из стандартного решения ранее подготовлены.
6.3. Артемия передачи, используя разрез пипетки Пастера из старых контейнеров тест трех новых контейнеров
Передача Артемия выполняется с помощью пипетки с достаточно большой диаметр, чтобы не повредить организмов. Во время этой фазы, 3 мл пластиковые пипетки Пастера (быть сокращены) могут быть использованы.
6.4. Личинки в стакан, содержащий либо живых или мертвых артемий
После 1 4 дня экспозицию в конце испытаний, число выживших личинок считается и записывается на листе. ЛК 50 и / или LC 20, NOEC и LOEC на 14 дней, рассчитаны и записаны, а также уверенность в пределах 95% в случае необходимости, и методы расчета.
7. Представитель Результаты
В конце теста (14 дней), вычислить процент смертности при каждой концентрации, в соответствии со следующей формулой:
(M S / N) * 100
Где:
М ы среднее число умерших лиц в анализируемой пробы
N-общее число лиц, подвергшихся воздействию
Таблица 1 отчеты пример данные теста (14г) с Артемия подвергается додецилсульфата натрия.
| Концентрации (мг / л) | "> Число умерших людей в каждой репликеСмертность (%) | |||
| Я | II | III | ||
| Отрицательный контроль | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1,56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3,12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6,25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12,5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
Кроме того, определениеЛК 50 по графическим гауссовский логарифмическом или с использованием соответствующих статистических методов (например, Спирмена-Karber или пробит метода). Расчет LC 50 для данных таблицы 1 8.18 (7.15-9.37), мг / л. Если максимальная концентрация испытании вызвано более низкой смертности на 50%, вы не должны переходить к расчету ЛК 50 значение, которое затем будет ненадежным или даже не вычислимо. В этом случае, однако, целесообразно повторить тест, расширяя диапазон концентраций испытания. Кроме того, величина ЛК 50 более правильно в виде большего, чем самая высокая концентрация испытания, возможно, указывает на процент смертности в наибольшей концентрацией проверены и высокая концентрация соответствующих никакого эффекта.
Результаты считаются действительными, если в конце тестирования следующие условия были соблюдены:
- Средняя смертность управления скоростьюсоставляет ≤ 20%;
- , где с помощью додецилсульфата натрия, ЛК 50 на 14 дней входит в 8.0 (± 5) мг / л интервала.
Если эти условия не были выполнены, все данные, полученные с той же партии организмов должны быть признаны недействительными и тестирования повторяется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Артемия является одним из самых ценных тест-организмов для тестирования экотоксичности и исследований, проведенных до сих пор позволяет нам утверждать, что можно сохранить несколько вариантов, связанных с использованием артемии в токсикологии и экотоксикологии. Характеристики, которые превращают этот организм в подходящий вид для биопробы являются: широкое географическое распространение, высокая приспособляемость к неблагоприятным условиям окружающей среды и разнообразных питательных веществ, относительно простых лабораторных культуры и обслуживания, устойчивость к манипуляциям, короткий жизненный цикл, большое производство потомства и наличие значительного объема информации о некоторых видов. Критика против использования артемии называют его чувствительность к воздействию химических веществ: более ранние исследования относятся артемии (тест до 24 часов экспозиции), а менее чувствительные виды на экотоксичности, по сравнению с другими организмами тест на тех же условиях эксперимента 3. Выборметод тестирования экотоксичности имеет решающее значение в этом отношении. Мы хотели, чтобы стандартизировать метод, который был тем же начальным условиям (науплии качестве тест-организма, полученных от использования кисты) протокол до 24 часов после контакта 4, но с относительно длинной выдержкой времени (14 дней) может обеспечить более чувствительный отклик. Этот протокол позволяет, конечно, более чувствительны, чем ответ острой испытания, но она не может быть использован в качестве замены для хронических тест, потому что воздействие в течение 14 дней не имеет значения, если мы рассматриваем оценку жизни артемии. Конечной точкой отбора этот метод был широко обсуждается. Первоначально смертности и роста (т.е. длина панциря после 14-дневной экспозиции) были выбраны, потому что мы также хотели бы обеспечить наблюдение сублетальных эффект для долгосрочного теста. Тем не менее, сублетальных конечной точки оказалась менее чувствительны по сравнению с смертность 6. По этой причине смертности является единственной конечной точки, упомянутые в неописуемойионных протокола и в видео. Этот вывод согласуется с исследованиями других исследователей 7,8 который отметил, что выживание является наиболее чувствительным конечной среди рассмотренных ими (выживание, рост и размножение).
Предлагаемый метод полезен для оценки токсичности химических веществ, сточных вод и экологические матрицы 9. В функции это может быть интересно для проверки другой сублетальный хронических токсических эффектов, таких как биомаркеров (например, ферментативная активность) 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
References
- Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
- Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).
- Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
- APAT IRSA-CNR. Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).
- Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
- Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica. Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).
- Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana. Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).
- Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA. Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).
- Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , UNICHIM. (2010).
- Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
