Summary
Dit onderzoek betreft de ontwikkeling en standaardisatie van een waardevolle methodologische protocol op lange termijn (14 dagen) dodelijke toxiciteit die wordt uitgeoefend door chemische stoffen, industrieel afvalwater of in de riolering en vloeibare milieu monsters op de zoutwater schaaldieren te bepalen,
Abstract
Onze onderzoeksactiviteiten gericht op het gebruik van biologische methoden voor de evaluatie van de milieukwaliteit, met bijzondere aandacht voor zout / brak water en sediment. De keuze van de biologische indicatoren moeten gebaseerd zijn op betrouwbare wetenschappelijke kennis en, eventueel, van de beschikbaarheid van gestandaardiseerde procedures. In dit artikel presenteren we een gestandaardiseerd protocol dat het mariene schaaldieren Artemia gebruikt om de toxiciteit van chemische stoffen en / of van het mariene milieu matrices te evalueren. Wetenschappers stellen dat de pekelkreeftjes (Artemia) is een geschikte kandidaat voor de ontwikkeling van een standaard bioassay voor wereldwijd gebruik. Een aantal kranten zijn gepubliceerd op de toxische effecten van verschillende chemische stoffen en toxische stoffen op artemia (Artemia). Het grote voordeel van deze schaal voor de toxiciteit studies is de algehele beschikbaarheid van de droge cysten, deze kan onmiddellijk worden gebruikt bij het testen en moeilijke teelt is niet vereist
Protocol
1. Methode Standaard
De testen zijn blootgesteld Artemia larven met een interval van stof concentraties of een monster voor het bepalen van de concentratie of verdunning niveau dat zou leiden tot de dood van 50% van de organismen (LC 50) blootgesteld gedurende 14 dagen aan bepaalde voorwaarden deze methode. Indien nodig en mogelijk is, kan bovendien het volgende worden bepaald: a) de concentratie niveau dat de dood van 20% van de blootgestelde organismen (LC 20) veroorzaakt; b) de hoogste geanalyseerd concentratie die geen vaststelling van een hogere sterftecijfer dan die van de negatieve controle (NOEC), de laagste geteste concentratie die bepaalt na 14 dagen een hogere sterftecijfer dan die van de negatieve controle (LOEC).
2. Testen Materiaal
2,1 Artemia eieren
Om testen uit te voeren, Artemia franciscana 5. Certified eieren of cysten gebruikt om tests te ondersteunen in de handel verkrijgbaar, bijvoorbeeld van de Quality Assurance Research Division, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, USA of van het Laboratorium voor Biologisch Onderzoek van Waterverontreiniging, Universiteit Gent, België.
2,2 Water verdunning
Synthetische zout kan worden gebruikt als verdunningswater bereid door pa reagentia of een commercieel verkrijgbare formulering met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Zout mengsels voor het creëren van de ideale zout water zijn commercieel verkrijgbaar, zoals de Instant Ocean mengsels. Het verdient aanbeveling het verdunningswater met een zoutgehalte gelijk aan 35 (± 2) voeding en een gehalte aan opgeloste zuurstof van meer dan 80% van de waarde van verzadiging en een temperatuur van 25 (± 2) endeg; C. Na 48 uur beluchten en filtratie van filters met een porositeit van ten minste 0,45 urn, kan de verdunning worden opgeslagen maximaal 30 dagen in het donker bij een temperatuur van 0-4 ° C.
2,3 algen cultuur
Het verdient aanbeveling die test organismen voeden zich met Dunaliella tertiolecta microalgen, die exponentieel groeien en te bereiken dichtheden van 1.3x10 6 - 2.0x10 6 cellen / ml. Testen op milieu monsters vereist culturen met een dichtheid hoger dan 2.0x10 6 cellen / ml 6. Er wordt gesuggereerd dat Dunaliella tertiolecta groeit in een cultuur die media die zeewater (30 (± 2) PSU en 20 (± 1) ° C) met toevoeging van essentiële voedingsstoffen, mineralen en vitaminen. Sommige aanduidingen op de algen media samenstelling en bereiding worden gerapporteerd in de bijlage. De eerste celdichtheid wordt voorgesteld ongeveer 10 5 cellen / ml. De algen cultuur in stand wordt gehouden in eenkamerthermostaat op 20 (± 1) ° C, verlicht met fluorescentielampen 3000 (± 300) lx, met een fotoperiode verhouding van 16 uur licht en 8 uur donker.
Andere fytoplanktonsoorten kunnen ook worden gebruikt voor het voederen maar het zou moeten vergelijkende studies maken met deze fytoplanktonsoorten de "equivalent" soorten vinden Dunaliella tertiolecta omdat de experimentele omstandigheden (bv. eerste celdichtheden licht verlichting, temperatuur, de samenstelling van cultuur media en belichtingstijd) varieert tussen fytoplankton soorten. Naast de tolerantie van de microalg verschillende verontreinigingen dient te worden beschouwd, aangezien de verontreinigende effect op de groei en ontwikkeling van fytoplankton effect ook de Artemia's.
2,4 Referentiestof
De verwijzing stof in deze test is natriumdodecylsulfaat.
2,5 Laboratoriumglaswerk
- Testen containers met 100 ml borosilicaatglas bekers (18 voor het testen en 18 voor het overbrengen van oplossingen uit te voeren).
- Een kolf (bijvoorbeeld 500 ml kolf) om de standaard oplossing te bereiden.
- Zes flessen (bijv. 200 ml flesjes) het testen oplossingen voor te bereiden.
- Glazen of polystyreen diameter van 5 cm petrischaaltjes met verwijderbare omvat wordt gebruikt voor het activeren van de cysten en de overdracht van de Artemia uitkomen schotel het testen containers.
- Glas Pasteurpipetten (met tips afgerond door vlam) voor het overbrengen van de nauplii.
- Glas canules of Pasteur 3 ml wegwerp plastic pipetten (te snijden) voor het overbrengen van Artemia.
- Micropipetten en gegradueerde pipetten om de test oplossingen voor te bereiden.
- Zes afgestudeerde cilinders (bv 50 ml cilinders) voor het overbrengen van het testen van oplossingen van de kolven op thij testen containers.
3. Cyste Activering
3.1. Platen met cysten + gieten van water
Om proeforganismen genereren, 20 mg van cysten geplaatst in een Petri schaal die 12 ml verdunningswater 48 uur vóór de test.
3.2. Incubatie in het licht en in het donker
De Petri-schaal wordt op 25 (± 2) ° C en een 4000 (± 1000) lux (lumen per vierkante meter) lichtintensiteit gedurende een uur.
3.3. Vervangen medium met de microscoop
Na 24 uur worden de arcering larven overgebracht naar een nieuwe petrischaal gevuld met kunstmatige water. De overdracht wordt uitgevoerd met behulp van de microscoop, dat wil zeggen met behulp van een lichtbron, zodat het uitkomen, phototropic larven migreren naar de lichtbundel. Een glazen Pasteur pipet wordt gebruikt om de transfer, zodat alleen de opkomende larven are overgedragen en niet de cysten en de larven nog membranen.
3.4. Incubatie in het donker
De schotel met de larven in een donkere thermostatische kamer voor 24 uur bij 25 (± 2) ° C.
4. Voorbereiding van Testing Solutions
4.1. Wegen van de stof + over te dragen aan de kolf
Het verdient aanbeveling de standaardoplossing voor het testen stof bereid door 0,5 g van de stof in een 500 ml kolf. De kolf wordt gevuld met gedeïoniseerd of gedestilleerd water en de oplossing wordt geroerd totdat het testen stof volledig is opgelost. Oplossingen worden bereid bij de tenzij hij niet bekend of de stof stabiel in oplossing is. In dat geval kan de standaardoplossing bereid tot twee dagen vóór de test.
4.2. Voorbereiden van de negatieve controle, het toevoegen van verdunningswater en algen wiste van de pipet van 10 ml
De negatieve controle bereid in een kolf (bijv. 200 ml) door toevoeging van een aliquot van de algensuspensie de verdunningswater zodat een dichtheid van 10 5 cellen / ml wordt verkregen.
4.3. De voorbereiding van de test-oplossingen: het toevoegen van verdunningswater, algen en standaardoplossing
Er wordt gesuggereerd dat onderzoek oplossingen worden bereid in vijf 200 ml flacons van toevoegen van de standaard oplossing aan het verdunningswater in de hoeveelheden gespecifieerd zodat de gewenste concentratie te testen verkregen. Om de organismen voeden kan aliquots Dunaliella tertiolecta microalgae suspensie kunnen worden gebruikt en toegevoegd aan een dichtheid van 10 5 cellen / ml bereikt wanneer de test-oplossingen worden bereid. De volgende volgorde van toevoeging is aan te bevelen: verdunningswater, algensuspensie en standaard oplossing. Na de bereiding van testoplossingen zij moeten worden gebruikt in de test zo spoedig mogelijk.
4.4. Overdracht van oplossingen van de kolf met het testen van containers, dan naar de petrischalen
Gelijke hoeveelheden (50 ml) van de testoplossingen worden ingevoerd in de test met gebruikmaking van de containers maatcilinder. Drie replica's voor elke concentratie worden gemaakt. Voor elke reeks proeven wordt controle container bereid met een hoeveelheid verdunningswater gelijk aan het volume van de testoplossingen. Gelijke volumes (ongeveer 12 ml) van de testoplossingen worden ingevoerd in de Petrischalen. Voor elke reeks proeven wordt controle petrischaal gebruikt.
5. Voorbereiding voor het testen
5.1. Nauplii de II-III fase
Achtenveertig uur na cyste activering van de nauplii bereiken II-III larvale stadium zijn dan bruikbaar voor testen.
5.2. Nauplii overdracht de platen met de microscoop
De Petri-schaal voor cyste activering wordt uit de thermostatische kamer. Een kleine hoeveelheid larven worden overgebracht naar de platen met de controle en de testoplossingen. Deze taak wordt uitgevoerd met de microscoop met behulp van een pipet voldoende grote diameter, zodat de organismen niet beschadigd. In deze fase van de test, kan de overdracht worden uitgevoerd met een glazen Pasteur pipet (met afgeronde punt door de vlam) en een zijwaarts geplaatste lichtbron dat de Artemia aanmoedigt samen te voegen.
5.3. Nauplii overdracht van de platen in de test container met de microscoop
Ten larven worden van de testoplossingen Petri schalen in de test containers. Ook deze operatie worden uitgevoerd door gebruikmaking van de pasteurpipet en microscoop. Het verdient aanbeveling een volume van ten hoogste 1 ml overgebracht tijdens het passeren van larven niet de totale hoeveelheid van testsysteem beïnvloeden.
e_step "> 5.4. Volle containers bedekt met parafilmHet testen bekers worden bedekt met parafilm (waarbij een opening luchtdoorlaat) en op een temperatuur van 25 (± 2) ° C gedurende de gehele duur van de test en een verlichting van 900 (± 100) lx met een fotoperiode verhouding van 14 uur licht tot 10 uur van de duisternis.
6. Het vervangen van de Medium and Food Supplement
6.1. Survival rate control
Twee dagen na de test gestart en na 5, 7, 9 en 12 dagen wordt de Artemia onder de microscoop de overleving te verifiëren en het medium en het voedingssupplement vervangen.
Aantal levende organismen geteld in elke test container. Na observatie onder de microscoop en lichte mechanische stimulatie (bijvoorbeeld het aanraken van de larven met een glas Pasteur pipet) organismen die wat beweging vertonen geen voor ongeveer 10 seconden moet worden als dood beschouwd.
6.2. Voorbereiding van een testoplossing met algen bemonstering met een 10 ml pipet en bemonstering van de stof worden getest met een micropipet. Het overbrengen van oplossingen uit de kolf op de proef containers
Bij het testen moet de testoplossingen periodiek worden vervangen en bereid op dezelfde dag als ze worden gebruikt. Testoplossingen worden gemaakt van de standaardoplossing eerder bereid.
6.3. Artemia-overdracht, gebruik te maken van een snee Pasteur pipet, van de oude test containers aan de drie nieuwe containers
De overdracht van Artemia wordt uitgevoerd met behulp van een pipet met een voldoende grote diameter, zodat geen de organismen beschadigen. Tijdens deze fase kan een 3 ml kunststof Pasteur pipet (te snijden) worden gebruikt.
6.4. Larven in een bekerglas met of dood of levend Artemia
Na 1 4 dagen blootstelling aan het einde van de test wordt het aantal overlevende larven geteld en geregistreerd op het werkblad. LC 50 en / of LC 20, worden NOEC en LOEC van 14 dagen, berekend en geregistreerd, evenals het vertrouwen van grenswaarden voor de 95% in voorkomend geval, en berekeningsmethoden.
7. Representatieve resultaten
Aan het einde van de proef (14 dagen) berekenen percentage mortaliteit in elke concentratie volgens de volgende formule:
(M s / N) * 100
Waar:
M s is gemiddeld aantal gestorven individuen in het geanalyseerde monster
N is het totale aantal blootgestelde personen
Tabel 1 geeft een voorbeeld van gegevens van test (14d) met Artemia blootgesteld aan natriumdodecylsulfaat.
| Concentraties (mg / l) | "> Aantal overleden personen in elke replicaMortaliteit (%) | |||
| Ik | II | III | ||
| Negatieve controle | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1,56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3,12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6,25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12,5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
Bovendien bepalenLC 50-waarde van een grafische Gaussiaanse logaritmische plot of met behulp van passende statistische methoden (bijvoorbeeld Spearman-Karber of Probit-methode). De berekening van LC 50 de gegevens van tabel 1 8,18 (7,15 tot +9.37) mg / l. Als de maximale concentratie geteste veroorzaakt een lager sterftecijfer van 50%, moet je niet overgaan tot de berekening van de LC 50-waarde die dan zou zijn onbetrouwbaar of zelfs niet-berekenbaar. In dit geval evenwel wenselijk de test herhaald door uitbreiding van het assortiment geteste concentraties. Ook kan de LC 50 waarde meer kunnen uitgedrukt als groter dan de hoogste geteste concentratie mogelijk wijst het percentage mortaliteit bij de hoogste geteste concentratie en de hoogste concentratie die overeenkomt met een geen effect.
De resultaten worden als geldig beschouwd als aan het eind van het testen van de volgende voorwaarden is voldaan:
- de controle van de gemiddelde sterftecijferis ≤ 20%;
- waarbij gebruik natriumdodecylsulfaat de LC 50 na 14 dagen is opgenomen in de 8,0 (± 5) mg / l interval.
Als de bovenstaande voorwaarden niet is voldaan, moeten alle gegevens die zijn verkregen met dezelfde batch van organismen worden als ongeldig beschouwd en testen herhaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artemia is een van de meest waardevolle testorganismen beschikbaar voor ecotoxicologische tests en onderzoek tot nu toe gedaan kunnen we stellen dat het mogelijk is om de ondersteuning van meerdere opties met betrekking tot Artemia gebruik in de toxicologie en ecotoxicologie. De kenmerken van dit organisme te zetten in een geschikte soorten voor bioassays zijn: een brede geografische spreiding, een hoog aanpassingsvermogen aan ongunstige milieu-omstandigheden en gevarieerde voedingsstoffen, relatief eenvoudige laboratorium-cultuur en het onderhoud, weerstand tegen manipulatie, korte levenscyclus, grote nakomelingen productie en de aanwezigheid van een aanzienlijke hoeveelheid informatie over enkele soorten. Een bezwaar tegen de toepassing van Artemia aangeduid zijn gevoeligheid voor chemische blootstelling: eerdere studies zie Artemia (proef 24 uur blootstelling) als minder gevoelig soorten ecotoxiciteitsstudies, in vergelijking met andere proeforganismen onder dezelfde proefomstandigheden 3. De keuze vanmethode voor ecotoxicologische tests is van cruciaal belang in dit opzicht. We wilden een methode die dezelfde startvoorwaarden (nauplii als een test organisme, verkregen uit het gebruik van cysten) van het protocol bij 24 uur blootstelling 4 had te standaardiseren, maar met relatief lange belichtingstijden (14 dagen) zou een meer gevoelige reactie. Dit protocol kan zeker gevoeliger dan de reactie acute tests maar kan niet worden gebruikt als vervanging voor testgegevens omdat blootstelling van 14 dagen is niet relevant als we de schatting levensduur van Artemia. Het eindpunt selectie voor deze methode is op grote schaal besproken. In eerste instantie zowel de sterfte en de groei (dat wil zeggen lengte van de schaal na 14 dagen blootstelling) werden geselecteerd, omdat we wilden ook de waarneming van een subletale effect voor een lange termijn-test te verzekeren. Maar de subletale eindpunt gevonden minder gevoelig dan mortaliteit 6. Daarom sterfte de enige die in het eindpunt description van het protocol en in de video. Deze bevinding komt overeen met studies van andere onderzoekers 7,8 die opmerkte dat overleven is de meest gevoelige eindpunt onder hen door hen beschouwd (overleving, groei en voortplanting).
De voorgestelde methode is handig voor het evalueren van de toxiciteit van chemicaliën, afvalwater en milieu-matrices 9. In de functie is het misschien interessant om andere sub-letale chronische toxische effecten, zoals biomarkers (dat wil zeggen enzymatische activiteit) 10 te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Geproduceerd door Loredana Manfra van Instituut voor milieubescherming en onderzoek (Ispra-Department of Environmental Quality Monitoring) en Federica Savorelli van regionale agentschap voor milieubescherming (Emilia-Romagna, Italië).
Referentie leden voor de sub-werkgroep over de Artemia schaaldieren binnen de biologische methoden Groep - Saltwater / brak water en sediment van de UNICHIM Commissie op de waterkwaliteit (het instituut voor de technische normen die in de chemische sector).
Videografie en te bewerken, Marco Pisapia van Ispra (Web Unit).
Productie Coördinatie door Anna Maria Cicero en Erika Magaletti van Ispra (Department of Environmental Quality Monitoring).
We willen het Gewestelijk Agentschap bedanken voor milieubescherming van Emilia-Romagna, Ferrara Branch, de biologische methoden Groep - Saltwater / BrakWater en sediment van de UNICHIM Commissie op de waterkwaliteit en Luciana Migliore, Tor Vergata Universiteit (Rome) voor hun medewerking, Rossella Boscolo en Massimo Gabellini van Ispra (Afdeling Preventie en tegengaan van de effecten) voor hun financiële steun, Fabio Matassa en de London School van de talen in Rome voor hun taalkundige ondersteuning.
References
- Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
- Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).
- Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
- APAT IRSA-CNR. Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).
- Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
- Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica. Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).
- Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana. Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).
- Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA. Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).
- Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , UNICHIM. (2010).
- Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
