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Biology

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana doi: 10.3791/3790 Published: April 14, 2012

Summary

Cette étude concerne le développement et la standardisation d'un protocole méthodologique précieux pour déterminer à long terme (14 jours) toxicité létale exercée par des substances chimiques, les eaux usées industrielles ou des eaux usées et liquides des échantillons environnementaux sur le crustacé d'eau salée,

Abstract

Nos activités de recherche cibler l'utilisation de méthodes biologiques pour l'évaluation de la qualité de l'environnement, avec une référence particulière à l'eau salée / eau saumâtre et les sédiments. Le choix des indicateurs biologiques doivent être fondées sur des connaissances scientifiques fiables et, éventuellement, de la disponibilité des procédures normalisées. Dans cet article, nous présentons un protocole standardisé qui a utilisé la crustacés marins Artemia pour évaluer la toxicité des produits chimiques et / ou de marins matrices environnementales. Des scientifiques proposent que la crevette de saumure (Artemia) est un candidat approprié pour le développement d'un bio-essai standard pour l'utilisation dans le monde entier. Un certain nombre de documents ont été publiés sur les effets toxiques des produits chimiques divers et des substances toxiques sur la crevette de saumure (Artemia). L'avantage majeur de ce crustacé pour les études de toxicité est la disponibilité globale des kystes secs; ceux-ci peuvent être immédiatement utilisés dans les essais et la culture difficile n'est pas exigé 3. La méthode proposée consiste à la mortalité comme critère d'évaluation. Les chiffres de survivants ont été comptés et le pourcentage de décès ont été calculés. Les larves ont été considérés comme morts si elles ne présentent pas de tout mouvement interne ou externe pendant plusieurs secondes d'observation 4. Cette procédure était de tests normalisés d'une substance de référence (dodécyl sulfate de sodium); certains résultats sont rapportés dans ce travail. Cet article accompagne une vidéo qui décrit les performances des tests de toxicité de la procédure, montrant toutes les étapes liées au protocole.

Protocol

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1. La méthode standard

Notre test consiste à exposer les larves d'Artemia à un intervalle de concentrations de la substance ou un échantillon d'essai pour la détermination des niveaux de concentration ou de dilution qui causent la mort de 50% des organismes (CL 50) exposés pendant 14 jours et répondant aux conditions définies par cette méthode. Si nécessaire et possible, celui-ci peut également être déterminée: a) le niveau de concentration qui provoque la mort de 20% des organismes exposés (LC 20); b) le niveau le plus élevé de concentration qui n'a pas analysé de déterminer un taux de mortalité plus élevé que celui de le contrôle négatif (CSEO), le niveau plus faible concentration testée qui détermine, après 14 jours, soit un taux de mortalité plus élevé que celui du contrôle négatif (CMEO).

2. Testing Materials

2.1 oeufs d'Artemia

Pour effectuer des tests, Artemia franciscana 5. Oeufs certifiés ou des kystes utilisés pour soutenir les essais sont disponibles dans le commerce, par exemple, de la Division de la recherche d'Assurance Qualité, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, États-Unis ou du laboratoire de recherche biologique dans la pollution aquatique, Université de Gand, en Belgique.

2,2 dilution de l'eau

D'eau salée synthétique peut être utilisé comme eau de dilution, préparée en dissolvant reconnus réactifs de qualité analytique ou une formulation disponible dans le commerce dans l'eau distillée ou désionisée. Mélanges de sel pour la création de l'eau salée idéale sont disponibles dans le commerce, par exemple, les mélanges Instant Ocean. Il est recommandé une eau de dilution à une salinité égale à 35 (± 2) ainsi que PSU une concentration en oxygène dissous supérieure à 80% de la valeur de saturation et une température de 25 (± 2) etdeg; C Après l'aération pendant 48 heures et de filtration dans des filtres de porosité d'au moins 0,45 m, la dilution peut être conservé pendant un maximum de 30 jours dans l'obscurité à une température de 0-4 ° C.

2.3 Culture des algues

Il est recommandé que les organismes d'essai sont l'alimentation sur la Dunaliella tertiolecta microalgues, qui se développent de façon exponentielle et atteignent des densités de 1.3x10 6 - 2.0x10 6 cellules / ml. Les essais sur les échantillons de l'environnement exige des cultures avec des densités supérieures à 2,0.10 6 cellules / ml 6. Il est suggéré que Dunaliella tertiolecta pousse dans un milieu de culture contenant l'eau de mer (30 (± 2) et 20 PSU (± 1) ° C) avec l'ajout de nutriments essentiels, des minéraux et des vitamines. Quelques indications sur la composition des algues médias et la préparation sont rapportés dans l'annexe. La densité cellulaire initiale est suggéré à environ 10 5 cellules / ml. La culture d'algues est maintenu dans unthermostat d'ambiance à 20 (± 1) ° C, éclairé par des lampes fluorescentes 3000 (± 300) lx, avec un ratio photopériode de 16 heures de lumière à 8 heures d'obscurité.

Autres espèces de phytoplancton pourrait également être utilisé pour l'alimentation, mais il serait nécessaire de faire des études comparatives avec ces espèces de phytoplancton pour trouver les «équivalent» à Dunaliella espèces tertiolecta, parce que les conditions expérimentales (par exemple des densités cellulaires initiales, l'éclairage de lumière, température, composition de la milieux de culture et temps d'exposition) varie selon les espèces de phytoplancton. Outre la tolérance de la micro-algues à différents polluants doit être pris en compte car les effets des polluants sur la croissance et le développement de l'impact du phytoplancton aussi à l'Artemia.

2,4 substance de référence

La substance de référence dans ce test est le dodécylsulfate de sodium.

2.5 Verrerie de laboratoire

  1. Conteneurs d'essais, y compris 100 ml béchers en verre de borosilicate (18 pour effectuer des tests et 18 pour le transfert de solutions).
  2. Un flacon (flacon de 500 ml par exemple) pour préparer la solution standard.
  3. Six flacons (par exemple 200 flacons ml) de préparer les solutions de test.
  4. Verre ou polystyrène 5 cm de diamètre des boîtes de Pétri avec amovible couvre à être utilisé pour activer les kystes et transférer Artemia de l'antenne d'éclosion pour les récipients d'essai.
  5. Pipettes Pasteur en verre (avec des pointes arrondies par la flamme) pour transférer les nauplii.
  6. Verre canules ou Pasteur 3 ml pipettes en plastique jetables (à couper) pour transférer Artemia.
  7. Micropipettes et pipettes graduées pour préparer les solutions de test.
  8. Six éprouvettes graduées (par exemple 50 ml cylindres) pour le transfert de solutions de test à partir des flacons à til tester les conteneurs.

3. Activation kyste

3,1. Boîtes de Pétri contenant des kystes + de verser de l'eau

Pour générer les organismes d'essai, 20 mg de kystes sont placés dans une boîte de Pétri contenant 12 ml d'eau de dilution de 48 heures avant le test.

3,2. L'incubation à la lumière et dans l'obscurité

La boîte de Pétri est maintenue à 25 (± 2) ° C et à une 4000 (± 1000) lux (lumens par mètre carré) intensité de la lumière pendant une heure.

3,3. Remplacement de la moyenne à l'aide du microscope

Après 24 heures, les larves sont transférées dans l'éclosion d'un nouveau plat de Pétri remplie d'eau artificielle. Le transfert est effectué à l'aide du microscope, c'est à dire en utilisant une source de lumière de telle sorte que l'éclosion, les larves migrent vers phototropique le faisceau de lumière. Une pipette Pasteur en verre est utilisé pour effectuer le transfert, veiller à ce que seules les larves naissant are transférées et non les kystes ou les larves encore dans les membranes.

3,4. L'incubation dans l'obscurité

Le plat contenant les larves est placé dans une chambre noire thermostatique pour 24 heures à 25 (± 2) ° C.

4. Préparation des solutions d'essai

4,1. Pesant la substance + de transférer dans le ballon

Il est recommandé que la solution standard pour la substance de test est préparée en dissolvant 0,5 g de la substance dans un flacon de 500 ml. Le ballon est rempli avec de l'eau déminéralisée ou distillée et la solution est agitée jusqu'à ce que la substance de test est complètement dissous. Des solutions doivent être préparés au moment de l'utilisation, sauf si on ne sait pas si la substance est stable en solution. Dans ce cas, la solution standard peut être préparée jusqu'à deux jours avant les tests.

4,2. Préparation du contrôle négatif, ajoutant de l'eau de dilution et les algues wie la pipette de 10 ml

Le contrôle négatif est préparée dans un flacon (par exemple le volume de 200 ml) en ajoutant une aliquote de la suspension d'algues à l'eau de dilution de telle sorte qu'une densité de 10 5 cellules / ml est obtenue.

4,3. Préparation des solutions de test: ajouter de l'eau de dilution, les algues et solution standard

Il est suggéré que des solutions de test sont préparés dans cinq flacons 200 ml en ajoutant la solution standard pour l'eau de dilution dans les quantités spécifiées de telle sorte que les concentrations souhaitées pour les tests est obtenu. Pour nourrir les organismes, des parties aliquotes d'une suspension Dunaliella microalgues tertiolecta peuvent être utilisés et ajoutés à atteindre une densité de 10 5 cellules / mL lorsque des solutions de test sont préparés. L'ordre de plus il est recommandé: l'eau de dilution, la suspension d'algues et de solution standard. Après la préparation de solutions de test, ils doivent être utilisés dans le test dès que possible.

4,4. Transfert des solutions à partir du ballon à des conteneurs de test, puis aux boîtes de Pétri

Des quantités égales (50 ml) des solutions de test sont introduits dans les récipients d'essai utilisant le cylindre gradué. Trois répliques pour chaque concentration sont faites. Pour chaque série de tests, un conteneur de contrôle est préparé avec une quantité d'eau de dilution égal au volume des solutions de test. Des volumes égaux (environ 12 ml) des solutions de test sont introduits dans les boîtes de Pétri. Pour chaque série de tests, un plat de contrôle de Petri est utilisée.

5. Préparation pour les essais

5.1. Nauplii au stade II-III

Quarante-huit heures après l'activation du kyste, les nauplii atteindre le stade II-III des larves et sont ensuite utilisables pour les tests.

5,2. Transfert Nauplii dans les boîtes de Pétri à l'aide du microscope

La boîte de Petri utilisé pour un kyste activation est retiré de la chambre thermostatique. Une petite quantité de larves sont transférées dans les boîtes de Pétri contenant le contrôle et les solutions de test. Cette tâche doit être effectuée avec le microscope en utilisant une pipette de diamètre suffisamment large afin que les organismes ne soient pas endommagés. Dans cette phase de l'essai, le transfert peut être effectué avec une pipette Pasteur en verre (avec bout arrondi par une flamme) et une source de lumière positionnée latéralement qui encourage l'Artemia à l'agrégation.

5,3. Transfert Nauplii des boîtes de Pétri dans les récipients d'essai avec le microscope

Dix larves sont transférées à partir des plats de test solutions de Pétri aux récipients d'essai. De plus, cette opération doit être effectuée en utilisant la pipette Pasteur et le microscope. Il est recommandé que le volume n'excède pas 1 ml est transféré lors du passage des larves de ne pas affecter le volume global du système d'essai.

e_step "> 5.4. Les conteneurs pleins recouverts de parafilm

Les béchers essais sont couverts avec du parafilm (en laissant un espace pour le passage de l'air), et maintenu à une température de 25 (± 2) ° C pendant toute la durée de l'essai et à un éclairement de 900 (± 100) lx avec une photopériode ratio de 14 heures de lumière à 10 heures d'obscurité.

6. Remplacement du Supplément de moyen et de l'Alimentation

6,1. Le taux de survie de contrôle

Deux jours après le test a commencé, et puis après quelques jours 5, 7, 9 et 12, l'Artemia est observée au microscope afin de vérifier le taux de survie et de remplacer le support et le complément alimentaire.

Nombre d'organismes vivants est compté dans chaque récipient d'essai. Après observation au microscope et une légère stimulation mécanique (par exemple de toucher les larves avec une pipette Pasteur en verre) les organismes qui ne présentent pas un mouvement pendant environ 10 secondes devrait être considérée comme morte.

6,2. Préparation d'une solution de test montrant l'échantillonnage d'algues avec une pipette de 10 ml et d'échantillonnage de la substance à tester avec une micropipette. Transfert des solutions du ballon aux récipients d'essai

Alors que les essais, les solutions d'essai doivent être remplacés périodiquement, et préparé dans la même journée car ils doivent être utilisés. Les solutions d'essai sont fabriqués à partir de la solution standard préalablement préparé.

6.3. Transfert Artemia, en utilisant une coupe pipette Pasteur, à partir des récipients d'essai de vieux aux trois nouveaux conteneurs

Le transfert de l'Artemia est effectuée en utilisant une pipette d'un diamètre suffisamment large pour ne pas endommager les organismes. Pendant cette phase, de 3 ml en plastique pipette Pasteur (à couper) peuvent être utilisés.

6,4. Les larves dans un bécher contenant soit vivant ou mort Artemia

Après 1 4 jours d'exposition à la fin de l'essai, le nombre de larves survivantes est compté et enregistré sur la feuille de calcul. CL 50 et / ou LC 20, CSEO et la CMEO de 14 jours, sont calculées et enregistrées, ainsi que les limites de confiance à 95% lorsque des méthodes appropriées, et le calcul.

7. Les résultats représentatifs

À la fin de l'essai (14 jours), calculer le pourcentage de mortalité à chaque concentration, selon la formule suivante:

(M s / N) * 100

Où:

M s est le nombre moyen de personnes sont mortes dans l'échantillon analysé

N est le nombre total de personnes exposées

Le tableau 1 présente un exemple de données d'un test (14d) avec Artemia exposés à dodécyl sulfate de sodium.

"> Nombre de personnes sont mortes dans chaque réplique
Concentrations (mg / L) Mortalité (%)
Je II III
Contrôle négatif 0 2 1 10
1,56 1 2 0 10
3,12 2 0 2 13
6,25 3 2 3 27
12,5 8 9 10 90
25,0 10 10 10 100
50,0 10 10 10 100

En outre, de déterminer laCL 50 par un complot graphique gaussien logarithmique soit en utilisant des méthodes statistiques appropriées (par exemple de Spearman-Karber ou la méthode Probit). Le calcul de la CL 50 pour les données du tableau 1 est de 8,18 (de 7,15 à 9,37) mg / l. Si la concentration maximale testée a provoqué une baisse du taux de mortalité de 50%, vous ne devriez pas procéder au calcul de la valeur CL 50 qui serait alors peu fiables, voire non-calculable. Dans ce cas, cependant, serait approprié de répéter le test en étendant la gamme des concentrations testées. Alternativement, la valeur CL 50 est plus correctement exprimée comme supérieure à la plus forte concentration testée, indiquant peut-être le pourcentage de mortalité à la plus forte concentration testée et la plus forte concentration correspondant à un effet non.

Les résultats sont considérés comme valides si à la fin de tester les conditions suivantes sont réunies:

  1. le contrôle de taux de mortalité moyenest ≤ 20%;
  2. où utilisant dodécylsulfate de sodium, le LC 50 à 14 jours est comprise dans l'8,0 (± 5) mg / l intervalle.

Si les conditions ci-dessus n'ont pas été respectées, toutes les données obtenues avec le même lot d'organismes devraient être considérés comme nuls et des tests répétés.

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Discussion

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Artemia est l'un des organismes d'essai les plus précieuses disponibles pour des essais d'écotoxicité et de la recherche fait jusqu'ici nous permet d'affirmer qu'il est possible de maintenir plusieurs options relatives à l'utilisation d'Artemia en toxicologie et écotoxicologie. Les caractéristiques qui font de cette organisme dans une espèce appropriée pour des essais biologiques sont les suivants: une répartition géographique large, une grande adaptabilité aux conditions environnementales défavorables et des éléments nutritifs variés, de la culture de laboratoire relativement simples et d'entretien, résistance à la manipulation, à court cycle de vie, de la production du gros veau et les l'existence d'une quantité considérable d'informations sur certaines espèces. Une critique contre l'utilisation de l'Artemia est renvoyé à sa sensibilité aux expositions aux produits chimiques: les études antérieures se référer Artemia (test à 24 heures d'exposition) en tant qu'espèce moins sensibles pour les études sur l'écotoxicité, par rapport à d'autres organismes d'essai dans les mêmes conditions expérimentales 3. Le choix d'méthode pour des essais d'écotoxicité est crucial à cet égard. Nous avons voulu normaliser une méthode qui a eu les mêmes conditions de départ (nauplii comme un organisme d'essai, obtenu à partir de l'utilisation des kystes) du protocole de 24 heures d'exposition 4, mais avec des temps d'exposition relativement longue (14 jours) pourrait fournir un plus réponse sensible. Ce protocole permet certainement une réponse plus sensible que les tests de toxicité aiguë, mais il ne peut pas être utilisé comme un substitut pour un essai chronique, car une exposition de 14 jours n'est pas pertinente si l'on considère l'estimation de la durée de vie d'Artemia. La sélection point de terminaison pour cette méthode a été largement discuté. Initialement à la fois la mortalité et la croissance (longueur de la carapace à-dire après 14 jours d'exposition) ont été sélectionnés, parce que nous voulions également nous assurer l'observation d'un effet sublétal pour un test à long terme. Toutefois, le point de terminaison sublétale a été jugée moins sensible par rapport à la mortalité 6. Pour cette raison, la mortalité est le critère n'est mentionné dans la description du protocole et dans la vidéo. Ce résultat est cohérent avec les études d'autres chercheurs qui ont observé 7,8 que la survie est le paramètre le plus sensible parmi ceux considérés par eux (la survie, la croissance et la reproduction).

La méthode proposée est utile pour évaluer la toxicité des produits chimiques, les effluents et les matrices environnementales 9. Dans la fonction qu'il pourrait être intéressant de tester d'autres sub-létaux des effets toxiques chroniques, telles que des biomarqueurs (c.-à-activité enzymatique) 10.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Produit par Loredana Manfra de l'Institut pour la protection de l'environnement et de la recherche (ISPRA-ministère de la surveillance de la qualité de l'environnement) et Federica Savorelli de l'Agence régionale pour la protection de l'environnement (Emilie-Romagne, Italie).

Membres de référence pour le Groupe de travail sur les sous-le crustacé Artemia au sein du Groupe des méthodes biologiques - Saltwater / eau saumâtre et des sédiments de la Commission sur la qualité de l'eau UNICHIM (l'institut de normalisation technique d'exploitation dans le secteur de la chimie).

Vidéographie et montage par Marco Pisapia de l'ISPRA (Web de l'Unité).

Coordination de la production par Anna Maria Cicéron et Erika Magaletti de l'ISPRA (ministère de la surveillance de la qualité de l'environnement).

Nous tenons à remercier l'Agence régionale pour la protection de l'environnement de l'Emilie-Romagne, Ferrare Direction, le Groupe des méthodes biologiques - Saltwater / saumâtreEau et des sédiments de la Commission sur la qualité de l'eau UNICHIM et Luciana Migliore, l'Université Tor Vergata (Rome) pour leur coopération; Rossella Boscolo et Massimo Gabellini de l'ISPRA (Département de la prévention et l'atténuation des impacts) pour leur soutien financier; Fabio Matassa et la London École de langues à Rome pour leur soutien linguistique.

References

  1. Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
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  3. Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
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  5. Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
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  10. Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé<em> Artemia franciscana</em
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Manfra, L., Savorelli, F., Pisapia, M., Magaletti, E., Cicero, A. M. Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana. J. Vis. Exp. (62), e3790, doi:10.3791/3790 (2012).More

Manfra, L., Savorelli, F., Pisapia, M., Magaletti, E., Cicero, A. M. Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana. J. Vis. Exp. (62), e3790, doi:10.3791/3790 (2012).

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