Summary
Bu çalışmada, kimyasal maddeler, endüstriyel atık su veya kanalizasyon ve tuzlu kabuklu sıvı çevresel örneklerde tarafından uygulanan uzun vadeli (14 gün) ölümcül toksisite belirlemek için değerli bir metodolojik protokolünün geliştirilmesi ve standardizasyonu ile ilgilidir
Abstract
Bizim araştırma faaliyetleri tuzlu / acı su ve tortu özel referans ile, çevre kalitesinin değerlendirilmesi için biyolojik yöntemlerin kullanılmasını hedefliyoruz. Biyolojik göstergelerin seçimi standart prosedürlerin kullanılabilirliği, muhtemelen, güvenilir bilimsel bilgiye dayalı ve olmalıdır. Bu yazıda, kimyasal ve / veya deniz çevresel matrislerin toksisitesini değerlendirmek için deniz kabuklu Artemia kullanılan standart bir protokol mevcut. Bilim adamları, tuzlu su karidesi (artemia) dünya çapında kullanım için standart biyoassay gelişimi için uygun bir aday olduğunu öneriyorum. Kağıtları bir dizi tuzlu su karidesi (artemia) çeşitli kimyasallar ve toksik maddelerin toksik etkileri üzerine yayınlanmıştır. Toksisite çalışmaları için bu canlıya en büyük avantajı, kuru kistler genel durumu ise; bu hemen test kullanılabilir ve zor ekimi talep edilmez
Protocol
1. Yöntem Standart
Bizim test organizmaların% 50 ölüm (LC 50) 14 gün boyunca maruz neden olacak konsantrasyonu veya seyreltme düzeylerini belirlemek amacıyla madde konsantrasyonları bir aralık veya bir test örneği için Artemia larvaları teşhir ve belirlenen şartlar içerir Bu yöntem. Gerekli ve mümkün olursa, şu da tespit edilebilir: a) maruz kalan organizmaların% 20 (LC 20) ölümüne sebep konsantrasyon seviyesi, b) daha yüksek bir ölüm oranı belirlemek değil, en yüksek analiz konsantrasyon seviyesi Negatif kontrol (NOEC); 14 gün, negatif kontrol (LOEC) daha yüksek bir ölüm oranı sonra, belirler düşük seviyede test edilen konsantrasyon.
2. Test Malzeme
2.1 Artemia yumurtaları
Testi gerçekleştirmek için, Artemia Franciscana 5 elde, evre II ve III de gereklidir. Test desteklemek için kullanılan Sertifikalı yumurta veya kistler, Kalite Güvence Araştırma Bölümü, ABD Çevre Koruma Ajansı, Cincinnati, OH 45268, USA veya Su Kirliliğinin Biyolojik Araştırmalar, Ghent Üniversitesi, Belçika Laboratuvar örneğin ticari olarak kullanılabilir.
2.2 Su seyreltme
Sentetik tuzlu kabul analitik kalite reaktifler veya distile veya deiyonize su içinde ticari olarak satılan bir formülasyon çözülmesiyle hazırlanmıştır, seyreltme suyu olarak kullanılabilir. İdeal tuzlu oluşturmak için tuz karışımlarının, ticari olarak mevcuttur, örneğin Instant Ocean karışımları. Bu, 35 (± 2) eşit olan bir tuz ile seyreltme su tavsiye edilir PSU yanı sıra doymuş değerin% 80'den fazla bir çözünen oksijen konsantrasyonuna ve 25 arasında bir sıcaklıkta (± 2) vedeg C. 48 saat ve en azından 0.45 mikron bir gözenek ile filtre filtrelenmesi için havalandırma sonra, seyreltme 0-4 ° C'lik bir sıcaklıkta karanlıkta 30 gün arasında bir maksimum saklanabilir
2.3 Alg kültürü
2.0x10 6 hücre / ml - Bu test organizmaları katlanarak artacak ve 1.3x10 6 yoğunlukları ulaşmak Dunaliella tertiolecta mikroalg, yem, olduğunu önerilir. Çevresel numuneler üzerinde test 2.0x10 6 hücre / ml 6 daha yüksek yoğunluklarda kültür gerektirir. Bu Dunaliella tertiolecta deniz suyu içeren bir kültür ortamında yetişen ileri sürülmektedir (30 (± 2) PSU ve 20 (± 1) ° C) temel besin, mineral ve vitamin ilavesi ile. Alg medya oluşumu ve hazırlık ilişkin bazı göstergeler Ek bildirilmektedir. İlk hücre yoğunluğu yaklaşık 10 5 hücre / ml olması tavsiye edilir. Alg kültür saklanır20 oda termostatı (± 1) ° C, karanlığın 8 saat ışık 16 saatlik bir periyodu oranı ile floresan lambalar 3000 (± 300) lx ile aydınlatılmıştır.
Diğer fitoplankton türlerinin de beslenme için kullanılan olabilir ama Dunaliella tertiolecta için "eşdeğer" türler bulmak için bu fitoplankton türleri ile karşılaştırmalı çalışmalar yapmak için gerekli olacaktır, çünkü deneysel koşullar (örn. başlangıç hücresi yoğunlukları, ışık aydınlatma, sıcaklık, bileşimi kültür ortamı ve maruz kalma süresi) fitoplankton türleri arasında değişir. Farklı kirleticiler için microalglerin tolerans düşünülmesi gereken yanı sıra, çünkü aynı zamanda Artemia için fitoplankton etki büyüme ve gelişme üzerindeki kirletici etkileri.
2.4 Referans madde
Bu testte referans madde sodyum dodesil sülfat olduğunu.
2.5 Laboratuar cam
- 100 ml borosilikat cam bardak (18 çözümler aktarılması için test ve 18 gerçekleştirmek için) dahil test kaplar.
- Standart çözelti hazırlamak için bir şişesi (örneğin 500 ml bir şişede).
- Test çözümleri hazırlamak için altı matara (örneğin 200 ml şişeler).
- Çıkarılabilir ile cam veya polistiren 5 cm çapında Petri kutularına kistler aktive ve test kaplara kuluçka çanağına Artemia aktarılması için kullanılmak üzere kapsar.
- Nauplii aktarmak için Cam Pasteur pipetler (alev yuvarlak uçları ile).
- Cam kanüller ve Artemia aktarmak için Pasteur 3 ml tek kullanımlık plastik pipetler (kesilecek).
- Mikropipetler ve dereceli pipetler test çözümleri hazırlamak.
- T matara gelen test çözümleri aktarmak için Altı dereceli silindir (örneğin 50 ml silindirler)O konteyner test.
3. Kist Etkinleştirme
3.1. Kistleri içeren Petri + su dökerek
Test organizmalar üretmek için, kistler, 20 mg 48 saat testten önce seyreltme suyun 12 ml içeren bir Petri tabağına yerleştirilir.
3.2. Işık ve karanlık Kuluçka
Petri (± 2) 25 tutulur ° C ve 4000 (± 1000) lüks (metre kare başına lümen) bir saat boyunca ışık şiddeti az.
3.3. Mikroskobu kullanılarak orta değiştirilmesi
24 saat sonra, kuluçka larva yapay su ile doldurulur, yeni bir Petri tabağı içine aktarılır. Transferi kuluçkalık, phototropic larvaları ışık demeti doğru göç böylece yani bir ışık kaynağı kullanarak, mikroskop kullanılarak yapılır. Bir cam Pasteur pipeti sadece olgunlaşmamış larvaların ar sağlanması, transferi yapmak için kullanılıre membranlar hala kist ya da larva transfer değil.
3.4. Karanlıkta Kuluçka
Larvalar içeren çanağı 25 C'de 24 saat karanlık termostatik haznesi yerleştirilir (± 2) ° C.
4. Test Çözümleri hazırlanması
4.1. Madde Tartı + şişesi transfer
Bu test madde için standart çözelti bir 500 ml'lik şişe içinde madde 0.5 g çözülmesi ile hazırlanır tavsiye edilir. Şişeye de-iyonize edilmiş su veya distile su ile doldurulur ve test madde tamamen eriyene kadar çözelti karıştırılır. Çözümlerin bu maddenin çözelti içinde stabil olup olmadığı bilinmemektedir sürece, kullanım sırasında hazırlanması gerekmektedir. Bu durumda, standart bir test çözeltisi iki gün önce kadar hazırlanabilir.
4.2. Seyreltme suyu ve yosun wi ekleyerek, negatif kontrol hazırlanması10 ml pipetle th
Negatif kontrol 10 5 hücre / ml 'lik bir yoğunluğa elde edilir, böylece su ile seyreltme alg süspansiyonu bir alikot eklenerek bir şişesi (örneğin 200 ml hacim) içinde hazırlanır.
4.3. Test çözümleri Hazırlanması: seyreltme suyu, yosun ve standart çözüm ekleyerek
Bu test çözümleri testleri için istenilen konsantrasyonu elde edilir, böylece belirtilen miktarlarda su ile seyreltme, standart çözeltisinin eklenmesi ile beş 200 ml'lik şişeler içerisinde hazırlanır ileri sürülmektedir. Organizmaların beslemek için bir Dunaliella tertiolecta mikroalg süspansiyon alikotları kullanılır ve test çözümleri hazırlanır olduğunda 10 5 hücre / ml bir yoğunluğa ulaşmak için ilave edilebilir. Ek aşağıdaki sırayla önerilir: seyreltme suyu, alg süspansiyon ve standart çözüm. Test çözeltilerinin hazırlanması sonra, kısa sürede ölçüm içinde kullanılabilir olması gerekir.
4.4. Sonra Petri kutuları için, şişesi test kapları çözümler aktarma
Test çözümleri eşit miktarlarda (50 ml) oldu silindir kullanılarak test kaplar içine tanıtılır. Her bir konsantrasyonu için üç kopyaları yapılır. Testler, her seri için, bir kontrol testi kabın çözeltilerinin hacmine eşit bir seyreltme bir miktar su ile hazırlanır. Test solüsyonları eşit hacimleri (12 ml) Petri kutularına sisteme dahil edilir. Testler, her seri için, bir kontrol Petri tabağı kullanılır.
5.. Test için hazırlık
5.1. II-III aşamasında nauplii
Kist aktif hale kırk sekiz saat, nauplii II-III larva ulaşmak ve test için daha sonra kullanabiliyorsunuz.
5.2. Mikroskop kullanılarak Petri içine nauplii transferi
Kist için kullanılan petri aktivasyon termostatik odasının dışına alınır. Larva küçük bir miktar kontrol ve test çözümleri içeren Petri aktarılır. Bu görev organizmaların zarar kalmamak için yeterince geniş çaplı bir pipet kullanılarak mikroskop ile gerçekleştirilen olmaktır. Test Bu aşamada, transferi bir cam Pasteur pipeti (alev yuvarlak uçlu) ve agrega için Artemia teşvik eden bir yanal olarak yerleştirilmiş ışık kaynağı ile yapılabilir.
5.3. Mikroskop ile test kaplara Petri gelen nauplii transferi
On larvaları test kaplara test çözümleri Petri kutularına aktarılır. Ayrıca, bu işlem Pasteur pipet ve mikroskop kullanılarak yapılmalıdır. Bu, 1 mL aşmayan bir hacim test sisteminin genel hacmi etkilemediği larvaların geçiş sırasında transfer edilmesi tavsiye edilir.
e_step "> 5.4. Tam konteyner parafilm kaplıTest bardak parafilm (hava geçişi için bir boşluk bırakarak) ile kaplı, ve 25 bir sıcaklık (± 2) ° C testi tüm süresi ve 900 (± 100) lx bir aydınlatma bir periyodu ile de korunur karanlığın 10 saat ışık 14 saat arasındaki orandır.
6. Orta ve Gıda Takviyesi Değiştirilmesi
6.1. Yaşama oranı kontrolü
Test başladıktan iki gün sonra, ve daha sonra 5, 7, 9 ve 12 gün sonra, Artemia hayatta kalma oranı doğrulamak için ve orta ve gıda ek yerine mikroskop altında görülmektedir.
Canlı organizmaların sayısı her test konteyner sayılır. Mikroskop altında gözlem ve hafif mekanik stimülasyonu (örneğin bir cam Pasteur pipeti ile larva dokunmadan) yaklaşık 10 s için bazı hareket görünmüyor organizmalar sonrasaniye basılı tutun ölü düşünülmelidir.
6.2. Mikropipet ile test edilecek maddenin bir 10 ml pipet ve örnekleme ile yosun örnekleme gösteren bir test solüsyonu hazırlanması. Şişesi test kapları çözümler aktarma
Test sırasında, test çözümleri periyodik olarak değiştirilmesi ve bunlar kullanılacaksa aynı gün içinde hazır olmalıdır. Test solüsyonları, önceden hazırlanmış standart bir çözüm yapılır.
Üç yeni konteyner eski testi kapları 6.3. Artemia transferi, bir kesim Pasteur pipeti kullanarak,
Artemia'nın transferi şekilde organizmalar zarar vermemek için yeterince geniş bir çapa sahip bir pipet kullanılarak gerçekleştirilir. Bu faz esnasında, bir 3 ml plastik Pasteur pipetle (kesilecek) kullanılabilir.
6.4. Ya canlı ya da ölü Artemia içeren bir cam kapta Larva
1 sonra Test sonunda maruz kalma 4 gün, larvaların hayatta kalma sayısı sayılır ve çalışma kaydedilir. LC 50 ve / veya LC 20, NOEC ve 14. günlerde LOEC, hesaplanır ve kaydedilir, yanı sıra güven aralığı% 95, uygun ve hesaplama yöntemleri de.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Testi (14 gün) sonunda, aşağıdaki formüle göre, her bir konsantrasyonda ölüm yüzdesi hesaplanır:
(M s / N) * 100
Nerede:
M s analiz örnek ölen kişilerin ortalama sayısı
N maruz kalan bireylerin toplam sayısı
Tablo 1 Sodyum dodesil sülfat maruz Artemia ile bir test (14d) veri bir örnektir.
| Konsantrasyonlar (mg / l) | "Her çoğaltma ölen bireylerin> NumaraMortalite (%) | |||
| Ben | II | III | ||
| Negatif kontrol | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1.56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3.12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6.25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12.5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
Dahası, belirlemekGrafiksel bir Gauss logaritmik arsa veya uygun istatistiksel yöntemler (örneğin Spearman-Karber veya Probit Yöntemi için) kullanılarak LC 50 değeri. Tablo 1 ve veriler için LC 50 hesaplanması 8,18 (7,15-9,37) mg / l'dir. Maksimum konsantrasyon% 50 daha düşük bir ölüm oranı neden Sınanan varsa, o güvenilmez, hatta olmayan hesaplanabilir olurdu LC 50 değeri hesaplamasına devam etmemelisiniz. Bu durumda, bununla birlikte, test edilen konsantrasyon aralığı genişleterek testi tekrarlamak üzere uygun olacaktır. Alternatif olarak, LC 50 değeri daha doğru bir olasılıkla test edilen en yüksek konsantrasyonda ölüm oranı ve bir etkisi yoktur karşılık gelen yüksek konsantrasyon gösteren, test edilen en yüksek konsantrasyonda daha büyük olarak ifade edilir.
Aşağıdaki test koşulları sonunda yerine getirildiği takdirde Sonuçlar geçerli kabul edilir:
- kontrolü ortalama mortalite oranı≤% 20;
- 14 gün için sodyum dodesil sülfat, LC 50 kullanılarak 8.0 (± 5) mg / l aralığında yer alır burada.
Yukarıdaki şartlar yerine getirilmiş değil, organizmaların aynı parti ile elde edilen tüm veriler geçersiz kabul ve test tekrarlanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artemia bize Toksikoloji ve Ekotoksikoloji içinde Artemia kullanımı ile ilgili çeşitli seçenekler sürdürmek mümkün olduğunu ifade sağlar şimdiye kadar yapılan ecotoxıcıty test ve araştırma için mevcut en değerli test organizmaları biridir. Biyoanalizlerin için uygun bir tür olarak bu organizmanın açmak özellikleri şunlardır: Geniş bir coğrafi dağılımı, olumsuz çevre koşulları ve çeşitli besin maddeleri, nispeten basit laboratuvar kültür ve bakım, manipülasyona karşı direnç, kısa yaşam döngüsü, büyük yavru üretim ve yüksek adaptasyon Bazı türler hakkında bilgi önemli bir miktarda varlığı. Artemia kullanımına karşı bir eleştiri kimyasal maddelere olan duyarlılığını ifade edilir: daha önceki çalışmalarda aynı deneysel koşullarda 3 altında diğer test organizmalar ile karşılaştırıldığında, ecotoxıcıty çalışmalar için daha az hassas türler olarak Artemia (test 24 saat maruz kalma) bakın. Seçimiecotoxıcıty test yöntemi bu açıdan çok önemlidir. Biz maruz 4 24 saat protokolü aynı başlangıç koşullarının (kist kullanımından elde edilen bir test organizması olarak nauplii) vardı bir yöntem standardize etmek istedim, ama nispeten uzun pozlama süresi (14 gün) ile daha sağlayabilir duyarlı bir tepki. Bu protokol kesinlikle akut testlere göre daha duyarlı bir tepki veriyor ama biz Artemia tahmini ömrü düşünürsek 14 gün maruz alakalı değildir çünkü kronik bir test için bir yedek olarak kullanılamaz. Bu yöntem için son nokta seçimi çok tartışıldı. Biz de uzun vadeli bir test için bir öldürücü etkisi gözlem sağlamak istedim çünkü Başlangıçta mortalite ve büyüme (14 gün maruz kaldıktan sonra yani Kabuk uzunluğu), hem seçilmiştir. Bununla birlikte, subletal uç ölüm 6 kıyasla daha az hassas olduğu bulunmuştur. Bu nedenle ölüm descript bahsedilen tek nokta iseprotokol ve video iyon. Bu bulgu, hayatta onları (hayatta kalma, büyüme ve üreme) tarafından kabul olanlar arasında en hassas nokta olduğu gözlenen diğer araştırmacıların çalışmaları 7,8 ile tutarlıdır.
Önerilen yöntem kimyasallar, atık su ve çevresel matrisler 9 toksikliği değerlendirmek için yararlıdır. Özelliği bu tür biyolojik (yani enzimatik aktivite) 10 gibi diğer alt-ölümcül kronik toksik etkiler, test etmek için ilginç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Çevre koruma ve araştırma enstitüsünün Loredana Manfra (Çevre Kalitesi İzleme ISPRA-Bölümü) ve Çevre Koruma Bölge Ajansı (Emilia-Romagna, İtalya) Federica Savorelli tarafından hazırlanmıştır.
Tuzlu su / Kuyu Suyu ve UNICHIM Komisyonu Su Kalitesi (kimya sektöründe teknik standardizasyon çalışma için enstitusu) Tortu - Biyolojik Yöntemler Grubu içinde Artemia kabuklu üzerine alt çalışma grubu için referans Üyeleri.
ISPRA Marco Pisapia (Web Birimi) tarafından Videography ve düzenleme.
Anna Maria Cicero ve ISPRA Erika Magaletti (Çevre Kalitesi İzleme Bölümü) tarafından Üretim Koordinasyonu.
Tuzlu su / Acı su - Biz Emilia-Romagna Çevre Koruma, Ferrara Şubesi, Biyolojik Yöntemler Grup Bölgesel Ajansı teşekkür etmek istiyorumRossella Boscolo ve mali destek için ISPRA Massimo Gabellini (Önlenmesi ve Etkilerinin Azaltılması Bölümü);; Fabio Matassa ve Londra Su Kalitesi ve Luciana Migliore, onların işbirliği için Tor Vergata Üniversitesi (Roma) üzerine UNICHIM Komisyonu Su ve Sediment kendi dil desteği için Roma'da Yabancı Diller Yüksekokulu.
References
- Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
- Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).
- Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
- APAT IRSA-CNR. Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).
- Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
- Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica. Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).
- Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana. Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).
- Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA. Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).
- Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , UNICHIM. (2010).
- Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
